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摘 要 目的：建立松花粉中柚皮素HPLC法测定方法，提高松花粉质量标准。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）测定柚皮素含量，以甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）为流动相，检测波长为288 nm测定柚皮素的含量。结果：柚皮素质量浓度在10.0～216.0 μg/ml范围内线性关系良好（r=1.000 0），平均回收率99.26% ，RSD为1.04%（n=9）。运用该方法测得12批次不同产地的松花粉中柚皮素含量在0.13%～0.27%之间。结论：建立的HPLC分析方法操作简便、快速、专属性强、重复性好，可作为该松花粉的质量控制方法。
关键词 松花粉 柚皮素 高效液相色谱
中图分类号：R282.71； O657.72 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）09-0064-03
*基金项目：国家科技重大专项（民口）课题重大新药创制专项“扶正化瘀片抗肝纤维化的CMC及美国Ⅲ期临床试验”（2018ZX09737010）
Study on an HPLC method for the determination of naringenin content in pini pollen*
LI Rongsheng**， ZHANG Yujie， LIN Chaoying， PAN Yifeng***
（Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co.， LTD.， Shanghai 200942， China）
ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the determination of pini pollen naringenin to improve its quality standard. Methods： The content of naringenin was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） at 288 nm using methanol-0.05% phosphoric acid solution （45：55） as mobile phase. Results： The standard curve of naringenin showed good linearity in the range of 10.0-216.0 μg/ml （r=1.000 0）. The average recovery was 99.26% with RSD 1.04% （n=9）. The contents of naringenin in 12 batches of pini pollen from different origins were in the range of 0.13%-0.27%. Conclusion： The established HPLC method is simple， rapid， specific and reproducible， and can be used for quality control of pini pollen.
KEy WORDS pini pollen； naringenin； HPLC
松花粉為松科植物马尾松（Pinus massoniana Lamb.）、油松（Pinus tabulieformis Carr.）或同属数种植物的干燥花粉，别名松黄、松花，是我国传统的药食两用药材之一，具有收敛止血，燥湿敛疮的功效，可用于外伤出血、皮肤糜烂、湿疹、黄水疮等症[1-2]。松花粉是扶正化瘀片/胶囊（国药准字Z20020047/Z20050573）六味原药材之一，同时也是松花粉灵芝片、松花粉蒲公英颗粒等保健品的原材料之一。松花粉通常于春季花刚开时进行采摘，花穗晒干，收集花粉，除去杂质即得。干燥的松花粉呈光滑椭圆状，淡黄色，体质轻，易飞扬，手感滑润，不沉于水，气微香，味有油腻感，其营养丰富，含多种维生素类、多糖类、黄酮类、核酸类、脂肪酸类、氨基酸类，膳食纤维类等营养物质，有“花粉之王”之美称[3]。
松花粉于1985年就已被《中华人民共和国药典》收载，而《中华人民共和国药典》2015版和2020版中只有性状、显微鉴别、水分、总灰分作为质量控制。《上海市中药饮片炮制规范》现行版等各省、地方标准未对松花粉进行薄层鉴别和HPLC含量控制[4]。因此有必要建立松花粉含量测定方法，用以控制松花粉质量。研究表明，黄酮类属于松花粉的主要活性成分，总黄酮含量高达1.60%～2.95%[5-8]。松花粉中二氢黄酮类化合物柚皮素（C15H12O5）具有降血脂、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗纤维化等多种药理活性[9-11]，具有良好的药用价值。因此，本文建立了松花粉中柚皮素成分的含量测定方法[12]，并对多个产地松花粉柚皮素进行了含量测定，探究松花粉不同产地柚皮素含量规律，为扶正化瘀片/胶囊、其它含松花粉保健品提供研究数据，同时填补《中华人民共和国药典》中松花粉含量测定的空缺。
1 材料和方法
1.1 实验材料
松花粉样品由上海黄海制药有限责任公司提供。柚皮素对照品，批号：3597，纯度：98%，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；HPLC级甲醇和96%磷酸，均购自上海安谱科技股份有限公司。
1.2 实验仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海-恒科技有限公司）；XP-105电子天平（梅特勒-托利多公司）；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，上海迪科马分析技术有限公司）。 1.3 柚皮素含量测定方法
1.3.1 色谱条件
流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）；柱温：30 ℃；检测波长为288 nm；流速1.0 ml/min；进样量10 ml；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3 000。
1.3.2 溶液制备
1）对照品溶液的制备 取柚皮素对照品适量，精密称取，置容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含有80 μg的溶液。
2）供试品溶液的制备 取本品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，密塞，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用。
3）空白溶液制备 以70%乙醇按“供试品溶液”制备方法制备。
1.4 系统适用性考察
1.4.1 专属性
测定空白溶液，结果应柚皮素对照品溶液与空白溶液相同保留时间处无对应的色谱峰出现。
1.4.2 线性关系
将柚皮素对照品逐级稀释成9.3、15.6、25.9、43.2、72.0、120.0、216.0 μg/ml 7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素为横坐标，柚皮素峰面积为纵坐标，进行线性回归。
1.4.3 精密度试验
精密吸取柚皮素对照品10 ml，连续进样5针，计算柚皮素峰面积RSD，考察仪器精密度。
1.4.4 稳定性试验
取同一供试品溶液（批号：DYC200311），在室温放置0、2、4、8、12、24、48 h时取样测定，计算柚皮素含量，其RSD≤2%。
1.4.5 重复性试验
取同一批号供试品（批号：DYC200311）平行制备6份，进行柚皮素含量测定，计算RSD≤2%。
1.4.6 准确度试验
精密取同一批样品（批号：DYC200311）9份，分别精密加入低、中、高3个浓度水平的对照品溶液，测定原液与加标供试液，计算回收率和RSD值。
1.4.7 检测限和定量限
将对照品逐级稀释，分别按信噪比（S/N）等于10（定量限）和3（检测限）计算确定，检测相应的检测限和定量限。
2 结果
2.1 专属性
供试品和柚皮素对照品的HPLC保留时间相同，柚皮素与其他成分的色谱峰分离度良好，柚皮素对照品溶液与空白溶液相同保留时间处无对应的色谱峰出现（图1）。
2.2 精密度试验
柚皮素对照品溶液峰面积分别为：39.81、39.88、40.34、40.01、39.77，平均峰面积为：39.96，RSD为0.58%（≤2%），说明仪器精密度良好。
2.3 线性关系的考察
计算得回归方程为Y=0.590 1x+0.847 3，相关系数r=1.000 0，表明柚皮素质量浓度在10.0～216.0 mg/ml范围内有较好的线性关系。
2.4 重复性试验
重复性试验的结果表明，该方法重复性良好，RSD为0.52%（≤2%）（表1）。
2.5 稳定性试验
在室温放置不同时间时测定的柚皮素含量分别为：0.22%、0.21%、0.22%、0.21%、0.21%、0.21%、0.22%，RSD为0.31%（≤2%）。表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.6 准确度试验
柚皮素回收率在90%～108%范围内，平均回收率99.26%，RSD为1.04%。符合《中国药典》2015年版四部指导原则9101的要求（表2）。
2.7 定量限和检测限
对照品质量溶度为0.77 mg/ml（S/N=52）及1.29 mg/ml（S/N=84）时，检测均无干扰，因此确定检测限质量浓度为0.77 mg/ml、定量限质量浓度为1.29 mg/ml。
2.8 不同产地松花粉中柚皮素的含量测定
分别取不同产地药材12批次进行含量测定，柚皮素色谱峰的峰形对称尖锐、分离度良好（表3）。
3 讨论
本实验前期进行了松花粉破壁（室温、冷冻）处理、去脂（乙醚、石油醚）、提取溶剂（不同浓度的乙醇、甲醇）、提取方法（回流、超声）、提取时间、提取温度以及料液比等因素的考察。结果显示，药材粉碎方式对结果影响不大；未去脂条件下柚皮素含量较高；70%乙醇回流2 h提取为最佳提取方式。参考徐鹏程[13]对沙田柚幼果中柚皮素的含量测定研究，选择甲醇-水和甲醇-磷酸水溶液等体系考察，发现当加入0.05%磷酸時，效果较佳、基线平稳、峰形尖锐、分析采集时间适宜，故选择甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）体系作为流动相。
从含量测定结果数据分析，柚皮素普遍存在于不同产地、不同松树品种的松花粉中，且含量稳定，可作为松花粉质量控制的指标性成分。
综上所述，本研究建立的松花粉柚皮素HPLC含量测定方法具有操作简便、快速、专属性强、重复性好的特点。柚皮素在松花粉中含量稳定且高，故可作为松花粉药材质量控制的指标成分，对松花粉的研究具有重要意义，有助于药材后续研究和扶正化瘀片/胶囊及其他保健品的质量控制。
参考文献
[1] 朱巧莎， 侯占群， 段盛林， 等. 松花粉的主要活性成分及其功能的研究进展[J]. 食品研究与开发， 2019， 40（9）： 194-198.
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015年版四部[M].北京：中国医药科技出版社， 2015： 57-58.
[3] 徐佳， 张丽梅， 王立成， 等. 松花粉的抗氧化作用[J]. 吉林大学学报（理學版）， 2017， 55（6）： 1626-1630.
[4] 张瑞婷， 夏伟， 张述仁， 等. 松花粉活性成分研究进展[J].现代农业科技， 2018（16）： 235-236； 244.
[5] 杨志岩， 尹树花， 白明， 等. 油松花粉中总黄酮的提取研究[J]. 现代食品科技， 2008， 24（2）： 164-166.
[6] 回晶， 林家帅， 李天翼， 等. 松花粉黄酮提取物体外抗氧化作用的研究[J]. 辽宁大学学报（自然科学版）， 2014， 41（3）： 281-285.
[7] 李娜. 松花粉营养成分及生物活性的研究进展[J]. 安徽农学通报， 2008， 14（13）： 125-127.
[8] 高岩， 袁久志， 王禹孝， 等. 红松松针中黄酮类成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报， 2010， 27（7）： 539-543.
[9] 季鹏， 赵文明， 于桐. 柚皮素的最新研究进展[J]. 中国新药杂志， 2015， 24（12）： 1382-1386； 1392.
[10] 张天柱， 马春华， 樊湘泽. 柚皮素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用研究[J]. 中药药理与临床， 2013， 29（6）： 29-31.
[11] 马燕， 林宝琴， 李卫中， 等. 柚皮素大鼠在体肠吸收动力学的研究[J]. 中成药， 2012， 34（8）： 1487-1491.
[12] 唐雨， 张瑜， 袁久志， 等. 松花粉化学成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报， 2011， 28（6）： 429-432.
[13] 徐鹏程. 沙田柚幼果中柚皮素的含量测定研究[J]. 内蒙古医学杂志， 2016， 48（4）： 397-399.
关键词 松花粉 柚皮素 高效液相色谱
中图分类号：R282.71； O657.72 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）09-0064-03
*基金项目：国家科技重大专项（民口）课题重大新药创制专项“扶正化瘀片抗肝纤维化的CMC及美国Ⅲ期临床试验”（2018ZX09737010）
Study on an HPLC method for the determination of naringenin content in pini pollen*
LI Rongsheng**， ZHANG Yujie， LIN Chaoying， PAN Yifeng***
（Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co.， LTD.， Shanghai 200942， China）
ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the determination of pini pollen naringenin to improve its quality standard. Methods： The content of naringenin was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） at 288 nm using methanol-0.05% phosphoric acid solution （45：55） as mobile phase. Results： The standard curve of naringenin showed good linearity in the range of 10.0-216.0 μg/ml （r=1.000 0）. The average recovery was 99.26% with RSD 1.04% （n=9）. The contents of naringenin in 12 batches of pini pollen from different origins were in the range of 0.13%-0.27%. Conclusion： The established HPLC method is simple， rapid， specific and reproducible， and can be used for quality control of pini pollen.
KEy WORDS pini pollen； naringenin； HPLC
松花粉為松科植物马尾松（Pinus massoniana Lamb.）、油松（Pinus tabulieformis Carr.）或同属数种植物的干燥花粉，别名松黄、松花，是我国传统的药食两用药材之一，具有收敛止血，燥湿敛疮的功效，可用于外伤出血、皮肤糜烂、湿疹、黄水疮等症[1-2]。松花粉是扶正化瘀片/胶囊（国药准字Z20020047/Z20050573）六味原药材之一，同时也是松花粉灵芝片、松花粉蒲公英颗粒等保健品的原材料之一。松花粉通常于春季花刚开时进行采摘，花穗晒干，收集花粉，除去杂质即得。干燥的松花粉呈光滑椭圆状，淡黄色，体质轻，易飞扬，手感滑润，不沉于水，气微香，味有油腻感，其营养丰富，含多种维生素类、多糖类、黄酮类、核酸类、脂肪酸类、氨基酸类，膳食纤维类等营养物质，有“花粉之王”之美称[3]。
松花粉于1985年就已被《中华人民共和国药典》收载，而《中华人民共和国药典》2015版和2020版中只有性状、显微鉴别、水分、总灰分作为质量控制。《上海市中药饮片炮制规范》现行版等各省、地方标准未对松花粉进行薄层鉴别和HPLC含量控制[4]。因此有必要建立松花粉含量测定方法，用以控制松花粉质量。研究表明，黄酮类属于松花粉的主要活性成分，总黄酮含量高达1.60%～2.95%[5-8]。松花粉中二氢黄酮类化合物柚皮素（C15H12O5）具有降血脂、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗纤维化等多种药理活性[9-11]，具有良好的药用价值。因此，本文建立了松花粉中柚皮素成分的含量测定方法[12]，并对多个产地松花粉柚皮素进行了含量测定，探究松花粉不同产地柚皮素含量规律，为扶正化瘀片/胶囊、其它含松花粉保健品提供研究数据，同时填补《中华人民共和国药典》中松花粉含量测定的空缺。
1 材料和方法
1.1 实验材料
松花粉样品由上海黄海制药有限责任公司提供。柚皮素对照品，批号：3597，纯度：98%，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；HPLC级甲醇和96%磷酸，均购自上海安谱科技股份有限公司。
1.2 实验仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海-恒科技有限公司）；XP-105电子天平（梅特勒-托利多公司）；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，上海迪科马分析技术有限公司）。 1.3 柚皮素含量测定方法
1.3.1 色谱条件
流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）；柱温：30 ℃；检测波长为288 nm；流速1.0 ml/min；进样量10 ml；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3 000。
1.3.2 溶液制备
1）对照品溶液的制备 取柚皮素对照品适量，精密称取，置容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含有80 μg的溶液。
2）供试品溶液的制备 取本品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，密塞，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用。
3）空白溶液制备 以70%乙醇按“供试品溶液”制备方法制备。
1.4 系统适用性考察
1.4.1 专属性
测定空白溶液，结果应柚皮素对照品溶液与空白溶液相同保留时间处无对应的色谱峰出现。
1.4.2 线性关系
将柚皮素对照品逐级稀释成9.3、15.6、25.9、43.2、72.0、120.0、216.0 μg/ml 7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素为横坐标，柚皮素峰面积为纵坐标，进行线性回归。
1.4.3 精密度试验
精密吸取柚皮素对照品10 ml，连续进样5针，计算柚皮素峰面积RSD，考察仪器精密度。
1.4.4 稳定性试验
取同一供试品溶液（批号：DYC200311），在室温放置0、2、4、8、12、24、48 h时取样测定，计算柚皮素含量，其RSD≤2%。
1.4.5 重复性试验
取同一批号供试品（批号：DYC200311）平行制备6份，进行柚皮素含量测定，计算RSD≤2%。
1.4.6 准确度试验
精密取同一批样品（批号：DYC200311）9份，分别精密加入低、中、高3个浓度水平的对照品溶液，测定原液与加标供试液，计算回收率和RSD值。
1.4.7 检测限和定量限
将对照品逐级稀释，分别按信噪比（S/N）等于10（定量限）和3（检测限）计算确定，检测相应的检测限和定量限。
2 结果
2.1 专属性
供试品和柚皮素对照品的HPLC保留时间相同，柚皮素与其他成分的色谱峰分离度良好，柚皮素对照品溶液与空白溶液相同保留时间处无对应的色谱峰出现（图1）。
2.2 精密度试验
柚皮素对照品溶液峰面积分别为：39.81、39.88、40.34、40.01、39.77，平均峰面积为：39.96，RSD为0.58%（≤2%），说明仪器精密度良好。
2.3 线性关系的考察
计算得回归方程为Y=0.590 1x+0.847 3，相关系数r=1.000 0，表明柚皮素质量浓度在10.0～216.0 mg/ml范围内有较好的线性关系。
2.4 重复性试验
重复性试验的结果表明，该方法重复性良好，RSD为0.52%（≤2%）（表1）。
2.5 稳定性试验
在室温放置不同时间时测定的柚皮素含量分别为：0.22%、0.21%、0.22%、0.21%、0.21%、0.21%、0.22%，RSD为0.31%（≤2%）。表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.6 准确度试验
柚皮素回收率在90%～108%范围内，平均回收率99.26%，RSD为1.04%。符合《中国药典》2015年版四部指导原则9101的要求（表2）。
2.7 定量限和检测限
对照品质量溶度为0.77 mg/ml（S/N=52）及1.29 mg/ml（S/N=84）时，检测均无干扰，因此确定检测限质量浓度为0.77 mg/ml、定量限质量浓度为1.29 mg/ml。
2.8 不同产地松花粉中柚皮素的含量测定
分别取不同产地药材12批次进行含量测定，柚皮素色谱峰的峰形对称尖锐、分离度良好（表3）。
3 讨论
本实验前期进行了松花粉破壁（室温、冷冻）处理、去脂（乙醚、石油醚）、提取溶剂（不同浓度的乙醇、甲醇）、提取方法（回流、超声）、提取时间、提取温度以及料液比等因素的考察。结果显示，药材粉碎方式对结果影响不大；未去脂条件下柚皮素含量较高；70%乙醇回流2 h提取为最佳提取方式。参考徐鹏程[13]对沙田柚幼果中柚皮素的含量测定研究，选择甲醇-水和甲醇-磷酸水溶液等体系考察，发现当加入0.05%磷酸時，效果较佳、基线平稳、峰形尖锐、分析采集时间适宜，故选择甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）体系作为流动相。
从含量测定结果数据分析，柚皮素普遍存在于不同产地、不同松树品种的松花粉中，且含量稳定，可作为松花粉质量控制的指标性成分。
综上所述，本研究建立的松花粉柚皮素HPLC含量测定方法具有操作简便、快速、专属性强、重复性好的特点。柚皮素在松花粉中含量稳定且高，故可作为松花粉药材质量控制的指标成分，对松花粉的研究具有重要意义，有助于药材后续研究和扶正化瘀片/胶囊及其他保健品的质量控制。
参考文献
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[13] 徐鹏程. 沙田柚幼果中柚皮素的含量测定研究[J]. 内蒙古医学杂志， 2016， 48（4）： 397-399.