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本发明提供了一种定量测定血清样品中高密度脂蛋白胆固醇含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，其中，所述试剂Ⅰ含有多聚阴离子化合物、二价阳离子盐及分散型表面活性剂；所述试剂Ⅱ含有苯乙烯基苯酚聚氧乙烯（16）醚。此外，本发明还提供了一种装有本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的试剂盒，以及一种测定高密度脂蛋白胆固醇含量的方法。