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目的：建立一种新型的快速、高通量的埃可病毒25型（ECHO25）中和抗体检测方法,并初步评价其在ECHO25中和抗体筛选和血清流行病学调查中的应用价值。方法：应用免疫荧光方法筛选ECHO25高亲和性抗体并将其作为检测单抗,结合酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）建立ECHO25中和抗体检测方法;使用不同效价的血清评价该方法的准确性;采用所建立的中和方法对ECHO25单克隆抗体、临床血清样品进行检测。结果：建立了快速检测ECHO25中和抗体的Nt-ELISPOT方法,以ECHO25单克隆抗体5B9作为检测