【摘 要】
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目的 以6型黑猩猩腺病毒(AdC6)为载体,构建一组新型溶瘤腺病毒,使之获得瘤内特异性复制能力.在体内外检测其抑瘤效果,并探讨其溶瘤机制.方法 以AdC6载体为基础,以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动该腺病毒的复制相关基因E1A表达,获得重组溶瘤病毒AdC6-htertE1A-ΔE3,同源构建表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF/CSF2)的AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)、复制缺陷型的腺病毒AdC6-ΔE1-ΔE3.重组腺病毒在HEK293细胞中包装,纯化后进行酶切鉴定.
【机 构】
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天津医科大学基础医学院 病原生物学系 天津 300070
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目的 以6型黑猩猩腺病毒(AdC6)为载体,构建一组新型溶瘤腺病毒,使之获得瘤内特异性复制能力.在体内外检测其抑瘤效果,并探讨其溶瘤机制.方法 以AdC6载体为基础,以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动该腺病毒的复制相关基因E1A表达,获得重组溶瘤病毒AdC6-htertE1A-ΔE3,同源构建表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF/CSF2)的AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)、复制缺陷型的腺病毒AdC6-ΔE1-ΔE3.重组腺病毒在HEK293细胞中包装,纯化后进行酶切鉴定.以上述3种腺病毒感染不同种类的肿瘤细胞(RD、SW-620、HeLa、Huh7、RM-1与MC-38),24 h后Western blot检测CSF2的表达,72 h后CCK8实验检测肿瘤细胞的存活率.以上述3种腺病毒感染HeLa细胞,12 h、24 h、48 h后以Western blot检测凋亡信号通路蛋白表达水平.在C57BL/6小鼠背部皮下注射含有1×106个小鼠结肠癌MC38细胞或小鼠前列腺癌RM-1细胞的细胞悬液,建立2种荷瘤小鼠模型实验,分为4组,每组分别瘤内注射50μL的PBS、1×108 PFU的AdC6-ΔE1-ΔE3、AdC6-htertE1A-ΔE3、AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2).当PBS组荷瘤小鼠的肿瘤达到2500 mm3以上时统一处死小鼠,取肿瘤组织进行TUNEL染色,在显微镜下观察凋亡阳性细胞并计数.结果 酶切鉴定发现,成功构建了溶瘤病毒AdC6-htertE1A-ΔE3、AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)及AdC6-ΔE1-ΔE3.Western blot检测发现,AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)能够感染不同的肿瘤细胞,并稳定表达外源基因CSF2.CCK8实验结果表明AdC6-htertE1A-ΔE3和AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)对RD、SW-620、HeLa、Huh7、RM-1与MC-38等多种肿瘤细胞具有明显的杀伤效果;相较于复制缺陷的腺病毒AdC6-ΔE1-ΔE3,感染复数为100 MOI时的AdC6-htertE1A-ΔE3、AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)对肿瘤细胞的杀伤效果极为明显(P<0.05).Western blot实验证明AdC6-htertE1A-ΔE3和AdC6-htertE1A-ΔE3(CSF2)通过激活P53依赖的通路,诱导肿瘤细胞凋亡.在前列腺癌及结直肠癌荷瘤小鼠模型中注射溶瘤病毒可显著抑制肿瘤生长,甚至清除肿瘤.结论 以AdC6为载体的溶瘤病毒通过促凋亡机制在体内外杀伤肿瘤,具有治疗肿瘤的巨大潜力.
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