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目的:建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于胚胎干细胞建系及研究。方法:选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞,制作饲养层,使用不同浓度丝裂霉素C处理,以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果:ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12.5~14.5 d进行原代细胞分离;12.5 d为最佳分离时间;13.5和14.5 d分离的细胞需在3代以后使用;6代以前细胞可用于饲养层制作;20 mg/L丝裂霉素C作用2.5 h可达到较好的处理效果。结论:ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞,用于胚胎干细胞饲养层的制作。