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摘要[目的]筛选沙棘品种深秋红茎尖组织培养基配方。[方法]选用不同培养基，以7月中旬至8月下旬采集的大田茎尖为外植体，对沙棘品种深秋红的组织培养技术进行研究。[结果]最适初代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，最适愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L，最适继代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L，最适腋芽诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。[结论]该研究建立了沙棘品种深秋红茎尖组织培养技术，为其产业化生产奠定基础。
关键词沙棘；茎尖；组织培养
中图分类号S723.1文献标识码A文章编号0517-6611（2016）18-127-03
Abstract[Objective] The aim was to screen out culture medium formula for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong. [Method] By using different culture mediums， with stem tip collected from middle Jul. to late Aug. as explants， tissue culture technology of seabuckthorn variety Shenqiuhong was studied. [Result] The optimal primary culture medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L， the optimal callus induction culture medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L， the optimal subculture medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L， the appropriate axillary bud induction medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L. [Conclusion] The cultivation technique for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong is established， which will lay a foundation for industrialized production.
Key wordsSeabuckthorn； Stem tip； Tissue culture
沙棘（Hippophae rhamnoides L.）为胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（Hippophae L.）落叶灌木或小乔木，根系发达，枝叶茂密，适应能力极强，抗严寒，抗风沙耐干旱，是土壤贫瘠和沙漠化地区水土保持的先锋树种。沙棘主要生长在干旱、半干旱地区，抗逆能力强，有广泛的适应性，我国西北、华北、东北、西南各省均有分布，是一种集社会效益、生态效益、经济效益于一身的珍贵树种。近年来，沙棘以其独有的经济和生态上的双重优势越来越受到广泛关注，逐渐成为我国山区的一种宝贵植物资源。
随着西部大开发步伐的加快，山区绿化、生态农业建设急需大量的沙棘苗木，传统的分株繁殖、幼枝扦插繁殖已无法满足需要，而组织培养育苗由于不受季节和地域限制，既能达到快速繁育的目的，又能很好地保持良种特性的优势，尤其可对雌雄异株的沙棘做定性繁育，具有很大的发展前景。
沙棘组织培养研究已有相关报道[1-6]，但尚无可用于产业化生产的报道及配方。笔者以阿勒泰地区重点发展品种之一深秋红为试验材料，对其组织培养配方进行筛选，为今后产业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料于2015年7月中旬至8月下旬采于阿勒泰市沙棘庄园，取成年植株当年生枝条的茎尖为外植体。
1.2试验方法
1.2.1初代培养。
以茎尖为试材，先用自来水冲洗，再用洗洁精浸泡10 min，期间不断搅拌，然后用流动自来水清洗15 min，蒸馏水冲洗3遍，之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上，用0.1% HgCl2消毒3 min，期间不断振摇，最后用灭菌蒸馏水冲洗6次。 将茎尖放在灭菌的滤纸上将水分吸干，切成0.5～1.5 cm长，将茎尖基部叶片剥离，接种于初代培养基上，每瓶接种3个茎尖。初代培养基分别以1/2MS和1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、IBA和NAA。初始培养基设计10个处理：①1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；③1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/3MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑤1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑥1/2MS+6-BA 0.5 mg/L；⑦1/2MS+6-BA 0.2 mg/L；⑧1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；⑨1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L；⑩1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L。
1.2.2继代培养。
1.2.2.1茎尖基部愈伤组织诱导。
诱导愈伤组织时，将高于2 cm的初代芽接种至以1/2MS和1/3MS为基本培养基的继代培养基上，添加不同浓度的6-BA和IBA。愈伤组织诱导培养基设计4个处理：①1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；③1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/2MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.05 mg/L。 1.2.2.2增殖培养。
将初代无菌苗切下，再将茎尖和带有2～3片叶的茎段切分，茎尖接种至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L继代培养基上，带腋芽的茎段接种至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L继代培养基上。
1.3培养条件
蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，每瓶分装培养基25～35 mL，pH 5.6～6.0，培养室温度20～26 ℃，湿度40%～60%，光照强度2 000 lx，光照时间12～14 h/d 。
2结果与分析
2.1初代培养的建立
由表1可知，沙棘初代茎尖在培养基⑥和⑦上长势最好。在培养基①、②、⑤、⑧上萌发率低或生长较慢，其他培养基长势一般。6-BA浓度在0.2～0.5 mg/L未添加任何生长素时，对于7月中旬至8月下旬的茎尖有较好的侧芽诱导效果，生长快，分化芽数最多。当6-BA浓度在0.5 mg/L时，添加不同浓度的生长素IBA，结果表明，浓度低于0.2 mg/L时生长迅速，但后期易死亡，浓度达0.5 mg/L时，基部愈伤组织开始形成。而6-BA与NAA的组合则不适合深秋红初代培养。其中，培养基⑥即1/2MS+6-BA 0.5 mg/L成活率可达92.3%，平均分化芽数可达2.53，为适宜初代培养基（图1）。
2.2愈伤组织的诱导
将初代培养萌发的2～3 cm的侧芽无菌苗切下，转入继代培养基中，成功诱导出愈伤组织。适合诱导愈伤组织的培养基是1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导率达100%。在此培养基上，无菌苗生长迅速，15 d左右根部切口部位开始膨大，愈伤组织为黄绿色，继续培养至30 d左右时，茎尖生长缓慢或停止，根部愈伤组织明显增大，直径可达1.5 cm左右，当培养至40 d左右时，愈伤组织变深褐色失去活力甚至开始死亡。而在培养基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L上愈伤组织诱导率为663%，愈伤组织块较培养基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L的体积小，30 d时直径约1 cm，继续培养至40 d以上时，由愈伤组织萌发出少量芽，但愈伤组织转黑褐色，萌发的芽有玻璃化现象，无法正常生长（表2、图2）。
2.3继代培养
将初代形成的株高3 cm以上的无菌苗截成带腋芽茎段诱导增殖，转移至新的培养基上进行继代培养，经20 d左右培养后，当新芽高2 cm以上时，再切分成小段转接诱导增殖以达到扩繁的目的。茎尖在1/2MS+6-BA 05 mg/L+IBA 0.2 mg/L上长势迅速，茎段在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L上诱导腋芽萌发生长效果较好。但腋芽增殖系数较低，平均诱导腋芽数也少，难以满足快繁的要求（表3、图3、4）。
3结论与讨论
该研究以7月中旬至8月下旬采集的大田茎尖为外植体，对沙棘品种深秋红组织培养进行研究。结果表明，适宜初代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，适宜愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，适宜继代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L，适宜腋芽诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。
在初代培养时，单一使用细胞分裂素效果优于细胞分裂素和细胞生长素配合使用，其原因可能是此阶段的内源生长素含量较高。
在诱导腋芽时发现，通常一个叶腋着生一个腋芽，但繁殖系数偏低，原因可能是尚未筛选出最适的培养基配方。
褐化是沙棘组织培养中常见的问题，其创伤分泌出的酚类物质一旦接触空气便被氧化成醌类有毒物质，这些有毒物质积累在培养基中而使培养材料死亡[7]。在木本植物组织培养过程中，褐变受培养温度、外植体、激素浓度、光照等因素的影响[8～10] 。在该试验中，外植体接种前进行低温处理，即将冲洗过后的外植体密封置于4～6 ℃环境中3～5 h后接种，褐化现象受到一定程度的抑制，原因是低温使外植体代谢速度减缓，减少了醌类物质的形成[11]。
通过对沙棘品种深秋红进行组织培养试验，发现不同树龄、部位等的植株间外植体的差异对生长增殖影响较大。该试验虽已获得初步成功，但尚未达到快速繁殖及工厂化生产的目的，尚有许多问题有待进一步研究。
参考文献
[1] 孙兰英，单金友，王春艳，等.沙棘组织培养基筛选试验[J].沙棘，1998，11（3）：14-16.
[2] 徐虹，王俊峰，梁宗锁.沙棘组织培养技术研究现状及存在问题[J].沙棘，1999，12（1）：11-13.
[3] 李师翁，范小峰.大果良种沙棘愈伤组织诱导及植株再生的研究[J].西北植物学报，2001，21（2）：262-266.
[4] 徐虹，梁宗锁.沙棘组织培养技术的研究[J].西北植物学报，2001，21（2）：267-272.
[5] 赵国林，刘金郎.沙棘的组织培养和植株再生[J].植物生理学通讯，1989，25（1）：42.
[6] 郭春华，徐玉霞.沙棘优良品系茎尖组织培养技术初探[J].沙棘，2000，13（1）：26-27.
[7] 杜研，李毅，马彦军，等.几种影响沙棘组织培养外植体褐化因子分析[J].河北农业大学学报，2007，30（5）：40-43.
[8] 陈正华.木本植物组织培养及其应用[M].北京：高等教育出版社，1986.
[9] 徐振彪，傅作中.植物组织培养过程中的褐化现象[J].国外农学—杂粮作物，1997（1）：55-56.
[10] 高国训.植物组织培养过中的褐变问题[J].植物生理学通讯，1999，35（6）：501-505.
[11] 姬惜珠，王红，张爱军.木本植物离体快繁中常见问题及解决方法[J].河北果树，2005（2）：13-14.
关键词沙棘；茎尖；组织培养
中图分类号S723.1文献标识码A文章编号0517-6611（2016）18-127-03
Abstract[Objective] The aim was to screen out culture medium formula for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong. [Method] By using different culture mediums， with stem tip collected from middle Jul. to late Aug. as explants， tissue culture technology of seabuckthorn variety Shenqiuhong was studied. [Result] The optimal primary culture medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L， the optimal callus induction culture medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L， the optimal subculture medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L， the appropriate axillary bud induction medium was 1/2MS+6BA 0.5 mg/L. [Conclusion] The cultivation technique for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong is established， which will lay a foundation for industrialized production.
Key wordsSeabuckthorn； Stem tip； Tissue culture
沙棘（Hippophae rhamnoides L.）为胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（Hippophae L.）落叶灌木或小乔木，根系发达，枝叶茂密，适应能力极强，抗严寒，抗风沙耐干旱，是土壤贫瘠和沙漠化地区水土保持的先锋树种。沙棘主要生长在干旱、半干旱地区，抗逆能力强，有广泛的适应性，我国西北、华北、东北、西南各省均有分布，是一种集社会效益、生态效益、经济效益于一身的珍贵树种。近年来，沙棘以其独有的经济和生态上的双重优势越来越受到广泛关注，逐渐成为我国山区的一种宝贵植物资源。
随着西部大开发步伐的加快，山区绿化、生态农业建设急需大量的沙棘苗木，传统的分株繁殖、幼枝扦插繁殖已无法满足需要，而组织培养育苗由于不受季节和地域限制，既能达到快速繁育的目的，又能很好地保持良种特性的优势，尤其可对雌雄异株的沙棘做定性繁育，具有很大的发展前景。
沙棘组织培养研究已有相关报道[1-6]，但尚无可用于产业化生产的报道及配方。笔者以阿勒泰地区重点发展品种之一深秋红为试验材料，对其组织培养配方进行筛选，为今后产业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料于2015年7月中旬至8月下旬采于阿勒泰市沙棘庄园，取成年植株当年生枝条的茎尖为外植体。
1.2试验方法
1.2.1初代培养。
以茎尖为试材，先用自来水冲洗，再用洗洁精浸泡10 min，期间不断搅拌，然后用流动自来水清洗15 min，蒸馏水冲洗3遍，之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上，用0.1% HgCl2消毒3 min，期间不断振摇，最后用灭菌蒸馏水冲洗6次。 将茎尖放在灭菌的滤纸上将水分吸干，切成0.5～1.5 cm长，将茎尖基部叶片剥离，接种于初代培养基上，每瓶接种3个茎尖。初代培养基分别以1/2MS和1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、IBA和NAA。初始培养基设计10个处理：①1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；③1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/3MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑤1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑥1/2MS+6-BA 0.5 mg/L；⑦1/2MS+6-BA 0.2 mg/L；⑧1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；⑨1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L；⑩1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L。
1.2.2继代培养。
1.2.2.1茎尖基部愈伤组织诱导。
诱导愈伤组织时，将高于2 cm的初代芽接种至以1/2MS和1/3MS为基本培养基的继代培养基上，添加不同浓度的6-BA和IBA。愈伤组织诱导培养基设计4个处理：①1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；③1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/2MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.05 mg/L。 1.2.2.2增殖培养。
将初代无菌苗切下，再将茎尖和带有2～3片叶的茎段切分，茎尖接种至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L继代培养基上，带腋芽的茎段接种至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L继代培养基上。
1.3培养条件
蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，每瓶分装培养基25～35 mL，pH 5.6～6.0，培养室温度20～26 ℃，湿度40%～60%，光照强度2 000 lx，光照时间12～14 h/d 。
2结果与分析
2.1初代培养的建立
由表1可知，沙棘初代茎尖在培养基⑥和⑦上长势最好。在培养基①、②、⑤、⑧上萌发率低或生长较慢，其他培养基长势一般。6-BA浓度在0.2～0.5 mg/L未添加任何生长素时，对于7月中旬至8月下旬的茎尖有较好的侧芽诱导效果，生长快，分化芽数最多。当6-BA浓度在0.5 mg/L时，添加不同浓度的生长素IBA，结果表明，浓度低于0.2 mg/L时生长迅速，但后期易死亡，浓度达0.5 mg/L时，基部愈伤组织开始形成。而6-BA与NAA的组合则不适合深秋红初代培养。其中，培养基⑥即1/2MS+6-BA 0.5 mg/L成活率可达92.3%，平均分化芽数可达2.53，为适宜初代培养基（图1）。
2.2愈伤组织的诱导
将初代培养萌发的2～3 cm的侧芽无菌苗切下，转入继代培养基中，成功诱导出愈伤组织。适合诱导愈伤组织的培养基是1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导率达100%。在此培养基上，无菌苗生长迅速，15 d左右根部切口部位开始膨大，愈伤组织为黄绿色，继续培养至30 d左右时，茎尖生长缓慢或停止，根部愈伤组织明显增大，直径可达1.5 cm左右，当培养至40 d左右时，愈伤组织变深褐色失去活力甚至开始死亡。而在培养基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L上愈伤组织诱导率为663%，愈伤组织块较培养基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L的体积小，30 d时直径约1 cm，继续培养至40 d以上时，由愈伤组织萌发出少量芽，但愈伤组织转黑褐色，萌发的芽有玻璃化现象，无法正常生长（表2、图2）。
2.3继代培养
将初代形成的株高3 cm以上的无菌苗截成带腋芽茎段诱导增殖，转移至新的培养基上进行继代培养，经20 d左右培养后，当新芽高2 cm以上时，再切分成小段转接诱导增殖以达到扩繁的目的。茎尖在1/2MS+6-BA 05 mg/L+IBA 0.2 mg/L上长势迅速，茎段在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L上诱导腋芽萌发生长效果较好。但腋芽增殖系数较低，平均诱导腋芽数也少，难以满足快繁的要求（表3、图3、4）。
3结论与讨论
该研究以7月中旬至8月下旬采集的大田茎尖为外植体，对沙棘品种深秋红组织培养进行研究。结果表明，适宜初代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，适宜愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，适宜继代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L，适宜腋芽诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。
在初代培养时，单一使用细胞分裂素效果优于细胞分裂素和细胞生长素配合使用，其原因可能是此阶段的内源生长素含量较高。
在诱导腋芽时发现，通常一个叶腋着生一个腋芽，但繁殖系数偏低，原因可能是尚未筛选出最适的培养基配方。
褐化是沙棘组织培养中常见的问题，其创伤分泌出的酚类物质一旦接触空气便被氧化成醌类有毒物质，这些有毒物质积累在培养基中而使培养材料死亡[7]。在木本植物组织培养过程中，褐变受培养温度、外植体、激素浓度、光照等因素的影响[8～10] 。在该试验中，外植体接种前进行低温处理，即将冲洗过后的外植体密封置于4～6 ℃环境中3～5 h后接种，褐化现象受到一定程度的抑制，原因是低温使外植体代谢速度减缓，减少了醌类物质的形成[11]。
通过对沙棘品种深秋红进行组织培养试验，发现不同树龄、部位等的植株间外植体的差异对生长增殖影响较大。该试验虽已获得初步成功，但尚未达到快速繁殖及工厂化生产的目的，尚有许多问题有待进一步研究。
参考文献
[1] 孙兰英，单金友，王春艳，等.沙棘组织培养基筛选试验[J].沙棘，1998，11（3）：14-16.
[2] 徐虹，王俊峰，梁宗锁.沙棘组织培养技术研究现状及存在问题[J].沙棘，1999，12（1）：11-13.
[3] 李师翁，范小峰.大果良种沙棘愈伤组织诱导及植株再生的研究[J].西北植物学报，2001，21（2）：262-266.
[4] 徐虹，梁宗锁.沙棘组织培养技术的研究[J].西北植物学报，2001，21（2）：267-272.
[5] 赵国林，刘金郎.沙棘的组织培养和植株再生[J].植物生理学通讯，1989，25（1）：42.
[6] 郭春华，徐玉霞.沙棘优良品系茎尖组织培养技术初探[J].沙棘，2000，13（1）：26-27.
[7] 杜研，李毅，马彦军，等.几种影响沙棘组织培养外植体褐化因子分析[J].河北农业大学学报，2007，30（5）：40-43.
[8] 陈正华.木本植物组织培养及其应用[M].北京：高等教育出版社，1986.
[9] 徐振彪，傅作中.植物组织培养过程中的褐化现象[J].国外农学—杂粮作物，1997（1）：55-56.
[10] 高国训.植物组织培养过中的褐变问题[J].植物生理学通讯，1999，35（6）：501-505.
[11] 姬惜珠，王红，张爱军.木本植物离体快繁中常见问题及解决方法[J].河北果树，2005（2）：13-14.