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摘要：利用单核苷酸多态性标记（SNP）构建镇油6号等15个油菜品种（系）的指纹图谱，分析它们之间的遗传相似性，并通过聚类分析明确它们之间的关系；利用SSR标记分析5个品种的遗传相似系数，SNP标记与SSR标记的遗传相似系数间的相关系数为0.82，达显著水平，表明2种方法所得的指纹图谱间具有较高的一致性，但SNP标记指纹图谱所含差异位点信息较多，比SSR标记图谱更好。
关键词：油菜；品种；指纹图谱；聚类分析
中图分类号： S634.301文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0087-03
收稿日期：2014-02-28
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（11）1026]；江苏省科技支撑（农业）计划（编号：BE2013435）。
作者简介：顾炳朝（1956—），男，江苏常州人，副研究员，主要从事油菜育种与品种推广工作。Tel：（0511）87265433；E-mail：gbc0115@163.com。鉴别优良品种的DNA指纹特性，对品种保护具有重要意义。SSR等分子标记技术可鉴定个体或种群基因组之间的特异性DNA片段，通过大量的标记分析可对品种的指纹图谱作出鉴别[1-4]。为鉴别油菜的指纹图谱，学者通过十多年研究，制定了油菜指纹图谱的国家标准（GB/T 19557.1—2004），该标准从众多的标记中精选出40对引物用以鉴定油菜品种指纹图谱，具有工作量小、快速有效的特点。油菜品种的鉴定包括形态鉴定、标记鉴定、数量性状鉴定等多个方面。在SSR指纹图谱鉴定基础上，可能会发现某些品种的SSR标记图谱间没有或者仅有很小的差异，这并不意味着2个材料就是完全相同的，还需要进一步作种植鉴定[5-9]，若种植鉴定有差别可认为是2个品种。出现这种情况的原因可能是标记区段不能够覆盖油菜品种差异区段，或者指纹图谱不够精细导致品种基因组差异没被检测到。单核苷酸多态性标记（SNP）技术的出现，为指纹图谱鉴定提供了新方法[10-12]。采用芯片技术的SNP标记分析方法可以提供数量众多的标记信息，在基因定位和基因功能研究等方面应用广泛，也是指纹图谱鉴定的较好方法。油菜SNP芯片含有5.2万个标记位点，可否用于鉴别油菜的指纹图谱值得探讨。本研究首次采用了SNP标记技术，以油菜新品种镇油6号等为材料[13-14]，研究这些品种的指纹图谱，并且为油菜指纹图谱鉴定提供新方法。
1材料与方法
1.1材料
试验所用油菜品种8个，分别为镇油6号、Tapidor、中双11号、宁油16、史力佳、史力丰、秦优7号和油研817；以及镇江农业科学研究所育成品系8个，分别为ZJ196、ZJ197、ZJ254、ZJ263、ZJ267、ZJ426、ZJ427和ZJ429。
1.2DNA的提取
供试材料在长至6～8张真叶时取样，置于-80 ℃冰箱保存备用。SSR标记试验采用SDS法提取DNA，SNP标记试验采用CTAB法提取DNA。
1.3SSR标记试验方法
采用GB/T 19557.1-2004《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》中使用的40对SSR引物。SSR反应体系采用10 μL体系：1 μL DNA（50 ng/μL），1 μL 10× PCR Buffer，0.2 μL dNTPs（2mM），0.1 μL TaqE（5 U/μL），0.5 μL F-Primer（50 ng/μL），0.5 μL R-Primer（50 ng/μL），6.7 μL ddH2O。PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min；4 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后在72 ℃终延伸10 min，4 ℃冰箱保存。PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳电压为210 V，时间75 min。固定，渗透，漂洗，显色，最后拍照和记录位点。
1.4SNP标记试验方法
SNP标记试验采用Infinium芯片技术。供试材料的DNA样本交北京怡美通德公司完成DNA杂交和芯片检测，获得各个品种5.2万个SNP位点信息，作为指纹图谱信息。
1.5数据统计方法
各材料的SSR 扩增产物采用二元性编码，即以1代表有谱带，以0代表无谱带，将所得到的0和1数据按顺序排列构成品种的指纹图谱，计算遗传相似系数。用非加权组平均法（ UPGMA ），采用Nei氏距离作聚类分析，采用NTSYSpc 2.1软件绘制聚类图。
各品种的52 157个SNP位点信息，同样可作为指纹图谱信息，并且用于计算遗传相似系数。相似系数使用MATLAB软件计算，然后用NTSYSpc 2.1软件作聚类分析。
2结果与分析
2.1SNP标记指纹图谱
采用SNP芯片技术，检测了15个品种（系）的SNP标记多态性，并且利用多态性信息，计算了品种的相似系数和Nei氏距离（表1）。结果显示，ZJ197与ZJ427之间的相似性系数最小，为0.55；ZJ427与ZJ426及ZJ197与秦优7号的遗传相似性系数最大，为0.74；镇油6号与宁油16的遗传相似性系数为0.62；镇油6号与史力佳的系数为0.70，也比较大。镇油6号、宁油16号、史力佳都属于江苏本省品种，遗传系数居于中等水平。镇油6号与中双11号之间的相似性系数在0.59，与欧洲品种Tapidor的相似系数为0.61，是比较低的，说明遗传上相距较远。镇油6号与本单位育成的8个品系（以ZJ命名）材料间的相似系数在0.58～0.62之间，说明选用材料的遗传差异较大，这与试验选材指导思想一致。通过遗传相似系数可对不同材料作聚类分析（图1）。从较远距离的情况看，可归为2类，一类是ZJ426、ZJ427、ZJ429，其余12份材料可归为另外一类。聚类图可明确15个材料的遗传相似性情况，这为亲本选配和材料的遗传特性评估提供了依据。表115个油菜品种（系）的SNP标记遗传相似系数 品种（系）
2.2SNP标记与SSR标记指纹图谱的相关性
按照国家标准的方法，采用40对SSR核心引物对5个遗传材料的DNA进行PCR扩增，得到DNA特征带型（图2）。统计分析5个品种之间的指纹信息差别，得到遗传相似性系数为0.54～0.76，其中镇油6号和Tapidor的相似系数最小，为0.54，说明它们遗传关系远；而史力丰与史力佳之间的相似性系数最大，为0.76，说明两者遗传来源相近（表2）。这些结果与材料的遗传来源吻合较好。例如，史力丰和史力佳在遗传上属于系统系谱的后代，聚类上归为一类而且相似系数最大（图3）。可以看出，油菜SSR指纹图谱国家标准应用效果还是比较好的。
为研究SNP和SSR标记指纹图谱的一致性，采用相关性分析方法，计算SSR指纹图谱的遗传相似系数与SNP标记指纹图谱的相似系数间的相关性。结果表明，二者之间的相关系数为0.823 7，达显著水平，说明二者之间一致性较高，同时
表25个油菜品种的SSR标记遗传相似系数
品种遗传相似系数中双11号Tapidor史力丰史力佳Tapidor0.68史力丰0.580.60史力佳0.620.600.76镇油6号0.590.540.660.71
也说明2种方法所得的指纹图谱还是有一定差别的。
3讨论
物种的标记包括形态标记、生化标记、SSR标记、SNP标记等多种类型。从标记的丰富程度看，SNP标记的丰富程度最大，SSR标记的丰富程度较好，生化标记和形态标记的丰富程度最小。理论上，标记的丰富程度越高，则分辨品种间差别的能力越强。采用SSR标记开展作物指纹图谱鉴定从方法学上看是比较好的。SSR标记的多态性位点相对较多，目前油菜指纹图谱鉴定的国家标准中采用的40对引物基本可以鉴别大多数品种的指纹差异。若品种采用回交等方式育成，可能导致品种间仅有个别区段差别，此时SSR标记因为数量有限，不能够覆盖基因组，则有可能难以分辨品种间的指纹差别，因此在指纹鉴定结果出现质疑情况下，还需要进行形态鉴定，以便给出品种鉴定的更加可靠的结论。油菜SNP标记数量多达5万多个，近似平均覆盖在全基因组上，可以更好地鉴别品种间的细微差别，可能是品种指纹图谱鉴定的更好方法。但是用SNP标记鉴定指纹图谱也有相应不足：（1）SNP标记鉴定的成本较高，若只鉴定单个品种的指纹图谱，则成本高达2万元以上，若批量鉴定则成本会有所降低；（2）SNP标记技术依赖芯片技术，在芯片设计时需要根据若干亲本差异核苷酸位点设计探针，检测得到位点信息，那么亲本的选择对指纹图谱鉴定结果是有一定影响的；（3）SNP标记能够鉴别2个等位位点的差别，不能鉴别复等位性位点。
作物品种培育过程中，当形态性状达到一致时，即可认为遗传材料是稳定的。然而，此时个体间仍然会有一些不易察觉的数量性状差别，往往这种差别被认为是由环境作用影响的结果，不被重视，这会导致遗传材料因为环境改变而出现较大的遗传分离现象。SNP标记理论上可以鉴定纯合和杂合位点，那么就应该可以鉴别品种的纯合性。然而，对各个品种（系）的杂合位点统计结果表明，各个品种（系）的杂合位点范围是8.43%～40.76%。试验品种中无疑包括纯合品种，中双11号属于纯合亲本，其杂合位点率最低。纯合亲本出现杂合位点可能是芯片技术出现数据判读聚类分析智能性不够高所造成的。不过，杂合位点百分率作为个体杂合性的参考指标应该是有意义的。研究中发现镇油6号的杂合位点率比较低，为9.8%，说明该品种的纯合性比较好，而一些育种中间世代品系和杂交种的杂合位点百分率比较高。因此，从育种的角度看，利用遗传材料的SNP标记图谱可以帮助说明遗传纯合性问题，使纯合性判别更加有效。
参考文献：
[1]闫华超，高岚，李桂兰. 分子标记技术的发展及应用[J]. 生物学通报，2006，41（2）：17-19.
[2]赵淑清，武维华. DNA分子标记和基因定位[J]. 生物技术通报，2000（6）：1-4.
[3]Singh A，Singh P K，Singh R，et al. SNP haplotypes of the BADH1 gene and their association with aroma in rice （Oryza sativa L.）[J]. Molecular Breeding，2010，26（2）：325-338.
[4]Boisson M，Mondon K，Torney V，et al. Partial sequences of nitrogen metabolism genes in hexaploid wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，110（5）：932-940.
[5]朱勇良，黄凌哲，谢裕林，等. 利用SSR分子标记构建苏香粳1号的指纹图谱[J]. 江苏农业科学，2012，40（9）：34-35.
[6]陈锋，张洁夫，陈松，等. 江苏省油菜主栽品种的SSR指纹图谱分析[J]. 江苏农业科学，2010（6）：44-46.
[7]姚艳梅，徐亮，胡琼，等. 青海省几个主要春性甘蓝型油菜杂交种的SSR分析[J]. 中国油料作物学报，2008，30（4）：406-410.
[8]龙卫华，高建芹，浦惠明，等. 油菜新品种宁杂15号分子指纹图谱的构建[J]. 江苏农业学报，2009，25（6）：1238-1242.
[9]陈碧云，伍晓明，张冬晓，等. 国家冬油菜区试新品种的SSR指纹图谱分析[J]. 分子植物育种，2008，6（4）：709-716.
[10]蒋荧梅，刘春，吴刘成，等. SNP标记对角膜混浊小鼠突变相关基因的精细定位[J]. 遗传，2010，32（5）：486-491.
[11]Labate J A，Baldo A M. Tomato SNP discovery by EST mining and resequencing[J]. Molecular Breeding，2005，16（4）：343-349.
[12]郑德波，杨小红，李建生，等. 基于SNP标记的玉米株高及穗位高QTL定位[J]. 作物学报，2013，39（3）：549-556.
[13]岳绪国，顾炳朝，唐泽庆，等. 镇油6号的育种策略及优质高产栽培技术探讨[J]. 江西农业学报，2012，24（11）：46-48.
关键词：油菜；品种；指纹图谱；聚类分析
中图分类号： S634.301文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0087-03
收稿日期：2014-02-28
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（11）1026]；江苏省科技支撑（农业）计划（编号：BE2013435）。
作者简介：顾炳朝（1956—），男，江苏常州人，副研究员，主要从事油菜育种与品种推广工作。Tel：（0511）87265433；E-mail：gbc0115@163.com。鉴别优良品种的DNA指纹特性，对品种保护具有重要意义。SSR等分子标记技术可鉴定个体或种群基因组之间的特异性DNA片段，通过大量的标记分析可对品种的指纹图谱作出鉴别[1-4]。为鉴别油菜的指纹图谱，学者通过十多年研究，制定了油菜指纹图谱的国家标准（GB/T 19557.1—2004），该标准从众多的标记中精选出40对引物用以鉴定油菜品种指纹图谱，具有工作量小、快速有效的特点。油菜品种的鉴定包括形态鉴定、标记鉴定、数量性状鉴定等多个方面。在SSR指纹图谱鉴定基础上，可能会发现某些品种的SSR标记图谱间没有或者仅有很小的差异，这并不意味着2个材料就是完全相同的，还需要进一步作种植鉴定[5-9]，若种植鉴定有差别可认为是2个品种。出现这种情况的原因可能是标记区段不能够覆盖油菜品种差异区段，或者指纹图谱不够精细导致品种基因组差异没被检测到。单核苷酸多态性标记（SNP）技术的出现，为指纹图谱鉴定提供了新方法[10-12]。采用芯片技术的SNP标记分析方法可以提供数量众多的标记信息，在基因定位和基因功能研究等方面应用广泛，也是指纹图谱鉴定的较好方法。油菜SNP芯片含有5.2万个标记位点，可否用于鉴别油菜的指纹图谱值得探讨。本研究首次采用了SNP标记技术，以油菜新品种镇油6号等为材料[13-14]，研究这些品种的指纹图谱，并且为油菜指纹图谱鉴定提供新方法。
1材料与方法
1.1材料
试验所用油菜品种8个，分别为镇油6号、Tapidor、中双11号、宁油16、史力佳、史力丰、秦优7号和油研817；以及镇江农业科学研究所育成品系8个，分别为ZJ196、ZJ197、ZJ254、ZJ263、ZJ267、ZJ426、ZJ427和ZJ429。
1.2DNA的提取
供试材料在长至6～8张真叶时取样，置于-80 ℃冰箱保存备用。SSR标记试验采用SDS法提取DNA，SNP标记试验采用CTAB法提取DNA。
1.3SSR标记试验方法
采用GB/T 19557.1-2004《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》中使用的40对SSR引物。SSR反应体系采用10 μL体系：1 μL DNA（50 ng/μL），1 μL 10× PCR Buffer，0.2 μL dNTPs（2mM），0.1 μL TaqE（5 U/μL），0.5 μL F-Primer（50 ng/μL），0.5 μL R-Primer（50 ng/μL），6.7 μL ddH2O。PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min；4 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后在72 ℃终延伸10 min，4 ℃冰箱保存。PCR产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳电压为210 V，时间75 min。固定，渗透，漂洗，显色，最后拍照和记录位点。
1.4SNP标记试验方法
SNP标记试验采用Infinium芯片技术。供试材料的DNA样本交北京怡美通德公司完成DNA杂交和芯片检测，获得各个品种5.2万个SNP位点信息，作为指纹图谱信息。
1.5数据统计方法
各材料的SSR 扩增产物采用二元性编码，即以1代表有谱带，以0代表无谱带，将所得到的0和1数据按顺序排列构成品种的指纹图谱，计算遗传相似系数。用非加权组平均法（ UPGMA ），采用Nei氏距离作聚类分析，采用NTSYSpc 2.1软件绘制聚类图。
各品种的52 157个SNP位点信息，同样可作为指纹图谱信息，并且用于计算遗传相似系数。相似系数使用MATLAB软件计算，然后用NTSYSpc 2.1软件作聚类分析。
2结果与分析
2.1SNP标记指纹图谱
采用SNP芯片技术，检测了15个品种（系）的SNP标记多态性，并且利用多态性信息，计算了品种的相似系数和Nei氏距离（表1）。结果显示，ZJ197与ZJ427之间的相似性系数最小，为0.55；ZJ427与ZJ426及ZJ197与秦优7号的遗传相似性系数最大，为0.74；镇油6号与宁油16的遗传相似性系数为0.62；镇油6号与史力佳的系数为0.70，也比较大。镇油6号、宁油16号、史力佳都属于江苏本省品种，遗传系数居于中等水平。镇油6号与中双11号之间的相似性系数在0.59，与欧洲品种Tapidor的相似系数为0.61，是比较低的，说明遗传上相距较远。镇油6号与本单位育成的8个品系（以ZJ命名）材料间的相似系数在0.58～0.62之间，说明选用材料的遗传差异较大，这与试验选材指导思想一致。通过遗传相似系数可对不同材料作聚类分析（图1）。从较远距离的情况看，可归为2类，一类是ZJ426、ZJ427、ZJ429，其余12份材料可归为另外一类。聚类图可明确15个材料的遗传相似性情况，这为亲本选配和材料的遗传特性评估提供了依据。表115个油菜品种（系）的SNP标记遗传相似系数 品种（系）
2.2SNP标记与SSR标记指纹图谱的相关性
按照国家标准的方法，采用40对SSR核心引物对5个遗传材料的DNA进行PCR扩增，得到DNA特征带型（图2）。统计分析5个品种之间的指纹信息差别，得到遗传相似性系数为0.54～0.76，其中镇油6号和Tapidor的相似系数最小，为0.54，说明它们遗传关系远；而史力丰与史力佳之间的相似性系数最大，为0.76，说明两者遗传来源相近（表2）。这些结果与材料的遗传来源吻合较好。例如，史力丰和史力佳在遗传上属于系统系谱的后代，聚类上归为一类而且相似系数最大（图3）。可以看出，油菜SSR指纹图谱国家标准应用效果还是比较好的。
为研究SNP和SSR标记指纹图谱的一致性，采用相关性分析方法，计算SSR指纹图谱的遗传相似系数与SNP标记指纹图谱的相似系数间的相关性。结果表明，二者之间的相关系数为0.823 7，达显著水平，说明二者之间一致性较高，同时
表25个油菜品种的SSR标记遗传相似系数
品种遗传相似系数中双11号Tapidor史力丰史力佳Tapidor0.68史力丰0.580.60史力佳0.620.600.76镇油6号0.590.540.660.71
也说明2种方法所得的指纹图谱还是有一定差别的。
3讨论
物种的标记包括形态标记、生化标记、SSR标记、SNP标记等多种类型。从标记的丰富程度看，SNP标记的丰富程度最大，SSR标记的丰富程度较好，生化标记和形态标记的丰富程度最小。理论上，标记的丰富程度越高，则分辨品种间差别的能力越强。采用SSR标记开展作物指纹图谱鉴定从方法学上看是比较好的。SSR标记的多态性位点相对较多，目前油菜指纹图谱鉴定的国家标准中采用的40对引物基本可以鉴别大多数品种的指纹差异。若品种采用回交等方式育成，可能导致品种间仅有个别区段差别，此时SSR标记因为数量有限，不能够覆盖基因组，则有可能难以分辨品种间的指纹差别，因此在指纹鉴定结果出现质疑情况下，还需要进行形态鉴定，以便给出品种鉴定的更加可靠的结论。油菜SNP标记数量多达5万多个，近似平均覆盖在全基因组上，可以更好地鉴别品种间的细微差别，可能是品种指纹图谱鉴定的更好方法。但是用SNP标记鉴定指纹图谱也有相应不足：（1）SNP标记鉴定的成本较高，若只鉴定单个品种的指纹图谱，则成本高达2万元以上，若批量鉴定则成本会有所降低；（2）SNP标记技术依赖芯片技术，在芯片设计时需要根据若干亲本差异核苷酸位点设计探针，检测得到位点信息，那么亲本的选择对指纹图谱鉴定结果是有一定影响的；（3）SNP标记能够鉴别2个等位位点的差别，不能鉴别复等位性位点。
作物品种培育过程中，当形态性状达到一致时，即可认为遗传材料是稳定的。然而，此时个体间仍然会有一些不易察觉的数量性状差别，往往这种差别被认为是由环境作用影响的结果，不被重视，这会导致遗传材料因为环境改变而出现较大的遗传分离现象。SNP标记理论上可以鉴定纯合和杂合位点，那么就应该可以鉴别品种的纯合性。然而，对各个品种（系）的杂合位点统计结果表明，各个品种（系）的杂合位点范围是8.43%～40.76%。试验品种中无疑包括纯合品种，中双11号属于纯合亲本，其杂合位点率最低。纯合亲本出现杂合位点可能是芯片技术出现数据判读聚类分析智能性不够高所造成的。不过，杂合位点百分率作为个体杂合性的参考指标应该是有意义的。研究中发现镇油6号的杂合位点率比较低，为9.8%，说明该品种的纯合性比较好，而一些育种中间世代品系和杂交种的杂合位点百分率比较高。因此，从育种的角度看，利用遗传材料的SNP标记图谱可以帮助说明遗传纯合性问题，使纯合性判别更加有效。
参考文献：
[1]闫华超，高岚，李桂兰. 分子标记技术的发展及应用[J]. 生物学通报，2006，41（2）：17-19.
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[4]Boisson M，Mondon K，Torney V，et al. Partial sequences of nitrogen metabolism genes in hexaploid wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，110（5）：932-940.
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[6]陈锋，张洁夫，陈松，等. 江苏省油菜主栽品种的SSR指纹图谱分析[J]. 江苏农业科学，2010（6）：44-46.
[7]姚艳梅，徐亮，胡琼，等. 青海省几个主要春性甘蓝型油菜杂交种的SSR分析[J]. 中国油料作物学报，2008，30（4）：406-410.
[8]龙卫华，高建芹，浦惠明，等. 油菜新品种宁杂15号分子指纹图谱的构建[J]. 江苏农业学报，2009，25（6）：1238-1242.
[9]陈碧云，伍晓明，张冬晓，等. 国家冬油菜区试新品种的SSR指纹图谱分析[J]. 分子植物育种，2008，6（4）：709-716.
[10]蒋荧梅，刘春，吴刘成，等. SNP标记对角膜混浊小鼠突变相关基因的精细定位[J]. 遗传，2010，32（5）：486-491.
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