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【摘 要】PCR-DGGE用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，目前在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。以下文章简要地阐述了环境工程中相关技术的原理及其优点，并分析了该技术的现状、前景。
【关键词】环境工程;DGGE技术;废水生物处理 1.新技术在环境工程生物处理研究中的应用
由于PCR-DGGE技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muvzer等开辟了DGGE在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究，在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。
1．1在废水生物处理研究中的应用
PCR-DGGE技术在废水生物处理研究中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。
Lapara等研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响，DGGE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。
应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同，使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下，产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加，其菌群结构相似程度也越来越高。
硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤。但由于氨氧化细菌的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分離培养分析法研究氨氧化细菌相当费时、繁琐。许玫英等采用PCR扩增16SrDNA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术，分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性，并在国内首次采用PCR-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DGGE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理效果。
应用PCR-DGGE技术对城市污水化学一生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究，对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富，但是种群结构相差很大。说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。
R0wan等采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水，运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。
采用PcR-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化一缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究，确定了微生物的优势菌种，并进行了多样性分析，结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。
1．2 在废气生物处理研究中的应用
生物过滤是一种能有效处理恶臭和挥发性有机废气的气体污染控制技术。生物滤池和生物滤塔作为生物处理恶臭气体的简单有效的方法，得到了快速的发展。
采用PCR-DGGE技术研究除臭生物滤池中试装置中分别一处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，结合应用DGGE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化，并回收主要的DNA片段，结合PCR测序及T载体克隆测序，明确优势菌群的系统发育地位。结果表明，除臭生物滤池在不同的口H条件下，微生物的多样性及其丰度存在较大差别，强酸性对微生物具有较高的选择作用，与中性条件相比 微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间分布多样性差异，序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位。为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据，同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。
生物滤塔中微生物的种群结构以及微生物多样性对于恶臭气体的处理效率以及反应器的稳定运行至关重要。殷峻等应用DGGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论：填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少；与污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物处理研究中的应用
在污泥处理过程中，污泥的稳定化是…个相当重要的过程。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。傅以钢等用DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DGGE指纹图谱和相似性系数Cs值分析，发现随着反应的持续进行，微生态结构的Cs值越来越高，说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选，调整内部细菌种群结构，从而达至 适应环境的目的，在发酵过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。
2.技术的原理
2．1 DGGE的原理
变性梯度凝胶电泳技术是DNA指纹技术，是多态性分析技术的一种，其原理是；DNA进行电泳时使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶能够有区别地解链PCR扩增产物。长度相同而在碱基序列上存在差异的不同DNA在进行变性梯度凝胶电泳时，双链的解链需要不同的变性剂浓度，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。起初双链DNA以线状向正极移动，随著变性剂浓度的增，DNA中具有低G+C含量的序列的部分被打开，而高G+C含量的部分仍保持双链。DNA双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环形(即DNA部分熔化)，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降 以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。如此便能将具有相同长度而序列有差异的DNA分子分离开。尿素和甲酰胺通常被用作变性剂形成变性梯度。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。 2．2用于微生物生态研究的PCR-DGGE技术
DGGE技术一开始是在医学上用来检测基因突变，1993年，Muvzer等首次将该技术应用于微生物生态的研究。PCR-DGGE技术是结合聚合酶链式反应(PCR)，依据所扩增的独特的DNA的分离提供微生物群落多樣性的图案或轮廓。16SrRNA(或18SrDNA)分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守的序列区域和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究，是一种很好的度量生物进化关系的分子钟，有“分子计时器”之称。根据16srRNA保守序列设计特异性引物，对其基因的多变区进行扩增，扩增产物进行DGGE，对其产生的条带进行分析。也可以用DGGE技术分离一些特殊的功能基因如如甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmox)和氨加单氧酶α亚单位基因(amoA)片段的扩增产物，从而分析特殊生态环境中特殊的微生物如甲烷营养型细菌和氨氧化细菌的多样性和动态变化。所以该技术主要包括以下步骤：①样品总DNA提取及纯化；②样品16SrDNA(或18SrDNA)片段或特殊功能基因片断的PCR扩增；③对PCR扩增产物进行DGGE分离及分析。
Muyzer分析了分子大小相同但序列不同的16SrDNA片段，对细菌种群多样性、数量比例和系统等进行更为详尽的描述。并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。
3.分析
3．1用于生物处理研究中的优势
PCR-DGGE技术不需要微生物的分离和纯培养，可以直接从所研究的生物处理系统样品中抽提总DNA，对16SrRNA的可变区进行PCR扩增，扩增产物通过DGGE进行分离并进一步分析，所以能克服传统方法的不足，打破微生物可培养性的局限，能检测到难以纯培养或不能纯培养的微生物，也可避免了对一些生长缓慢的微生物如硝化细菌的检测和分析的费时和繁琐。
PCR-DGGE技术检测极限低，MUYZER等用这种方法能检测出数量仅占总群落数l％ 的微生物。在贫营养或含有毒物的生物处理系统中的微生物，不町能形成很复杂微生物群落结构和丰富的细菌数量，有些种类可能只有少量存在，但这种不在数量上占优势的菌群也可能在系统中起着重要的作用，检测极限低这一特点能在这种情况下发挥最大优势。
PCR-DGGE技术检测结果准确可靠 PCR-DGGE通常用指纹图谱中条带数目的多少来反映微生物种群的多样性，还可以半定量地测定样品DNA浓度的大小，反映微生物群落组成的变化，用条带的染色强度反映不同细菌种群的丰度，使原始样品中的不同细菌群落保持相对比例。
PCR-DGGE技术可同时检测多个样品，并且具有可重复性，特别适合分析优势种类和调查种群的时空变化，对生物处理系统微生物群落结构演替规律的研究有重要意义。
3．2 PCR-DGGE技术的局限性
PCR-DGGE技术只能分离较小的片段(达500bp)，较长的片段分离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。由于某些种类16SrDNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致细菌数量的过多估计。在有些情况下， 不同类型的细菌种群16SrDNA有着相同的迁移行为，一条DGGE条带是由不同细菌种群序列组成，这可能会低估环境微生物的种群多样性。
4.结束语
尽管PCR-DGGE技术具有以上局限性，但能克服传统方法的不足，打破微生物培养的局限性，可同时检测多个样品，结果快速准确，特别适合分析优势种群和调查群落的动态变化，是目前研究污染物生物处理系统中微生物群落遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术。该技术还可以与其它方法结合，如果结合测序技术，对DGGE凝胶上的DNA条带进行割胶回收，并克隆测序，然后与Genebank中的标准序列进行比较，从而鉴定群落成员；如果结合末端标记的荧光PCR产物和区内标准可用于检测稀少群落成员和便于样品与样品之间的精确比较；如果采用双梯度(结合聚丙烯酰胺梯度与变性剂梯度)DGGE分析能获得更好的分辨率；如果结合使用rRNA杂交技术，还可使检测极限降至0．1％左右。这种结合起来的方法将是研究生物处理系统中微生物生态的最有力的手段。这对更好地揭示生物处理系统中生物与环境之间的生态学关系以及为实现生物处理系统的优化运行具有深刻的理论研究意义与实际应用价值。
【关键词】环境工程;DGGE技术;废水生物处理 1.新技术在环境工程生物处理研究中的应用
由于PCR-DGGE技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muvzer等开辟了DGGE在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究，在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。
1．1在废水生物处理研究中的应用
PCR-DGGE技术在废水生物处理研究中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。
Lapara等研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响，DGGE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。
应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同，使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下，产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加，其菌群结构相似程度也越来越高。
硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤。但由于氨氧化细菌的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分離培养分析法研究氨氧化细菌相当费时、繁琐。许玫英等采用PCR扩增16SrDNA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术，分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性，并在国内首次采用PCR-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DGGE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理效果。
应用PCR-DGGE技术对城市污水化学一生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究，对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富，但是种群结构相差很大。说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。
R0wan等采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水，运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。
采用PcR-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化一缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究，确定了微生物的优势菌种，并进行了多样性分析，结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。
1．2 在废气生物处理研究中的应用
生物过滤是一种能有效处理恶臭和挥发性有机废气的气体污染控制技术。生物滤池和生物滤塔作为生物处理恶臭气体的简单有效的方法，得到了快速的发展。
采用PCR-DGGE技术研究除臭生物滤池中试装置中分别一处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，结合应用DGGE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化，并回收主要的DNA片段，结合PCR测序及T载体克隆测序，明确优势菌群的系统发育地位。结果表明，除臭生物滤池在不同的口H条件下，微生物的多样性及其丰度存在较大差别，强酸性对微生物具有较高的选择作用，与中性条件相比 微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间分布多样性差异，序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位。为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据，同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。
生物滤塔中微生物的种群结构以及微生物多样性对于恶臭气体的处理效率以及反应器的稳定运行至关重要。殷峻等应用DGGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论：填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少；与污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物处理研究中的应用
在污泥处理过程中，污泥的稳定化是…个相当重要的过程。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。傅以钢等用DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DGGE指纹图谱和相似性系数Cs值分析，发现随着反应的持续进行，微生态结构的Cs值越来越高，说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选，调整内部细菌种群结构，从而达至 适应环境的目的，在发酵过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。
2.技术的原理
2．1 DGGE的原理
变性梯度凝胶电泳技术是DNA指纹技术，是多态性分析技术的一种，其原理是；DNA进行电泳时使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶能够有区别地解链PCR扩增产物。长度相同而在碱基序列上存在差异的不同DNA在进行变性梯度凝胶电泳时，双链的解链需要不同的变性剂浓度，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。起初双链DNA以线状向正极移动，随著变性剂浓度的增，DNA中具有低G+C含量的序列的部分被打开，而高G+C含量的部分仍保持双链。DNA双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环形(即DNA部分熔化)，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降 以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。如此便能将具有相同长度而序列有差异的DNA分子分离开。尿素和甲酰胺通常被用作变性剂形成变性梯度。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。 2．2用于微生物生态研究的PCR-DGGE技术
DGGE技术一开始是在医学上用来检测基因突变，1993年，Muvzer等首次将该技术应用于微生物生态的研究。PCR-DGGE技术是结合聚合酶链式反应(PCR)，依据所扩增的独特的DNA的分离提供微生物群落多樣性的图案或轮廓。16SrRNA(或18SrDNA)分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守的序列区域和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究，是一种很好的度量生物进化关系的分子钟，有“分子计时器”之称。根据16srRNA保守序列设计特异性引物，对其基因的多变区进行扩增，扩增产物进行DGGE，对其产生的条带进行分析。也可以用DGGE技术分离一些特殊的功能基因如如甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmox)和氨加单氧酶α亚单位基因(amoA)片段的扩增产物，从而分析特殊生态环境中特殊的微生物如甲烷营养型细菌和氨氧化细菌的多样性和动态变化。所以该技术主要包括以下步骤：①样品总DNA提取及纯化；②样品16SrDNA(或18SrDNA)片段或特殊功能基因片断的PCR扩增；③对PCR扩增产物进行DGGE分离及分析。
Muyzer分析了分子大小相同但序列不同的16SrDNA片段，对细菌种群多样性、数量比例和系统等进行更为详尽的描述。并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。
3.分析
3．1用于生物处理研究中的优势
PCR-DGGE技术不需要微生物的分离和纯培养，可以直接从所研究的生物处理系统样品中抽提总DNA，对16SrRNA的可变区进行PCR扩增，扩增产物通过DGGE进行分离并进一步分析，所以能克服传统方法的不足，打破微生物可培养性的局限，能检测到难以纯培养或不能纯培养的微生物，也可避免了对一些生长缓慢的微生物如硝化细菌的检测和分析的费时和繁琐。
PCR-DGGE技术检测极限低，MUYZER等用这种方法能检测出数量仅占总群落数l％ 的微生物。在贫营养或含有毒物的生物处理系统中的微生物，不町能形成很复杂微生物群落结构和丰富的细菌数量，有些种类可能只有少量存在，但这种不在数量上占优势的菌群也可能在系统中起着重要的作用，检测极限低这一特点能在这种情况下发挥最大优势。
PCR-DGGE技术检测结果准确可靠 PCR-DGGE通常用指纹图谱中条带数目的多少来反映微生物种群的多样性，还可以半定量地测定样品DNA浓度的大小，反映微生物群落组成的变化，用条带的染色强度反映不同细菌种群的丰度，使原始样品中的不同细菌群落保持相对比例。
PCR-DGGE技术可同时检测多个样品，并且具有可重复性，特别适合分析优势种类和调查种群的时空变化，对生物处理系统微生物群落结构演替规律的研究有重要意义。
3．2 PCR-DGGE技术的局限性
PCR-DGGE技术只能分离较小的片段(达500bp)，较长的片段分离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。由于某些种类16SrDNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致细菌数量的过多估计。在有些情况下， 不同类型的细菌种群16SrDNA有着相同的迁移行为，一条DGGE条带是由不同细菌种群序列组成，这可能会低估环境微生物的种群多样性。
4.结束语
尽管PCR-DGGE技术具有以上局限性，但能克服传统方法的不足，打破微生物培养的局限性，可同时检测多个样品，结果快速准确，特别适合分析优势种群和调查群落的动态变化，是目前研究污染物生物处理系统中微生物群落遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术。该技术还可以与其它方法结合，如果结合测序技术，对DGGE凝胶上的DNA条带进行割胶回收，并克隆测序，然后与Genebank中的标准序列进行比较，从而鉴定群落成员；如果结合末端标记的荧光PCR产物和区内标准可用于检测稀少群落成员和便于样品与样品之间的精确比较；如果采用双梯度(结合聚丙烯酰胺梯度与变性剂梯度)DGGE分析能获得更好的分辨率；如果结合使用rRNA杂交技术，还可使检测极限降至0．1％左右。这种结合起来的方法将是研究生物处理系统中微生物生态的最有力的手段。这对更好地揭示生物处理系统中生物与环境之间的生态学关系以及为实现生物处理系统的优化运行具有深刻的理论研究意义与实际应用价值。