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摘要：目的：探讨紧密连接蛋白claudin-3在脑膜瘤中的表达对脑膜瘤的发生、血管生成的影响。方法：采用免疫组化方法检测63例脑膜瘤和10例正常硬脑膜组织中紧密连接蛋白claudin-3的表达，以CD105抗体标记血管内皮细胞，计数微血管密集度MVD。结果：①脑膜瘤组织claudin-3表达明显低于正常硬脑膜组织（P<0.05）。②正常脑膜组织MVD为3.60±1.05，6脑膜瘤组织中MVD为38.44±10.74，两者之间差异有显著性（P=<0.05）。③脑膜瘤组织中claudin-3阳性表达程度与MVD呈负相关（rS=-0.613，P<0.05）。结论：Claudin-3和肿瘤细胞增殖以及微血管形成关系密切，可能成为预测脑膜瘤生物学行为的一项重要指标。
关键词：脑膜瘤；紧密连接蛋白（claudin-3）；人类白血病相关细胞膜抗原（CD105）；血管生成；微血管密度（MVD）；免疫组化
脑膜瘤血运丰富，质地坚韧，新生血管多，在某些部位手术全切有一定困难，存在约为11%～12%的复发率。Claudins作为构成紧密连接的主要骨架蛋白，参与维持紧密连接的屏障功能和栅栏功能，进而影响细胞间的黏附能力，其磷酸化后，干扰紧密连接的形成，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。多项研究[1-4]证实Claudin-3在消化、生殖等多系统肿瘤中存在异常表达，提示Claudin-3可能在肿瘤的生物学特性上发挥作用。本研究拟采用免疫组化的方法对脑膜瘤中claudin-3的表达进行测定，以CD105抗体标记微血管测定微血管密度（MVD），观察claudin-3的表达强度与MVD以及新生血管生成的关系，分析紧密连接蛋白claudin-3在脑膜瘤中表达的意义，以期为脑膜瘤的诊疗、预防复发寻找新的思路和方法。
1 资料与方法
1.1一般资料
所有病例均经手术及病理检查证实，且病理诊断与临床资料完整的脑膜瘤患者，共计63例，其中男32例，年龄平均42.5±14岁；女31例，年龄平均43±13.3岁。病程1～84月，平均22.4+11.5月。另收集10例取自脑外伤手术病人的正常硬脑膜组织作对照。脑膜瘤病理标本按2006年颁布的WHO中枢神经系统肿瘤分型、分级标准分类[5]：I级30例（脑膜上皮型11例，纤维细胞型9例，沙粒型6例，混合型4例，）；II级21例（非典型性19例，透明细胞型脑膜瘤1例，脊索样型脑膜瘤1例）；Ⅲ级12例（间变型12例）。
1.2 研究方法
63例脑膜瘤标本作为研究组，10例正常脑膜标本为对照组。脑膜瘤标本Claudin-3、CD105免疫组化染色均按照试剂盒说明书采用SABC法规范操作。
1.3 结果判定
细胞胞浆出现黄色或棕褐色颗粒定义为claudin-3阳性表达，评分方法如下：阳性细胞染色强弱：阴性0分，着色弱但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者3分；阳性细胞的百分比：切片随机观察5个高倍视野，各计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。无阳性细胞者为0分，阳性细胞数小于25%者为1分，阳性细胞数占25%～50%者为2分，占51%～75%者为3分，﹥75%者为4分。上述两项相乘，0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。
血管内皮细胞膜和（或）细胞浆呈棕黄色或棕褐色着色定义为CD105蛋白染色阳性。凡被染成棕黄色或棕褐色的单个血管内皮细胞或细胞簇，只要其与邻近的微血管、肿瘤细胞或结缔组织成分有明显区别，就视为一个微血管而计数。低倍视野下确定新生血管形成最活跃的“热点”区域，再于高倍视野（×200倍）下计数。每张切片记录5个高倍视野下微血管数目（微血管切面数目），取其平均值作为该标本的MVD（个/视野）。
1.4 统计学处理
数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析：计量资料采用均数±标准差（ ±s）表示，率的比较采用LSD-t检验，χ2检验，两变量间相关性用Spearman等级相关分析。a=0.05。
2 结果
2.1 Claudin-3的表达与性别、年龄、肿瘤部位、大小差别无关。
2.2 免疫组化染色积分脑膜瘤组为7.00±2.38，低于对照组11.10±1.26，差异有统计学意义（P=0.000<0.05）。脑膜瘤组织中MVD的均值为38.44±10.74，对照组脑膜组织中MVD均值为3.60±1.05，明显低于肿瘤组织，差异有显著性（P=0.017 <0.05）。
2.3 对照组claudin-3的高表达者，MVD为3.6±1.05；脑膜瘤组中claudin-3的染色积分为1～4分者MVD为56.88±11.17，5～8分者MVD为35.43±4.14，9～12分者为MVD为28.30±3.94。在脑膜瘤组织中claudin-3阳性表达程度与MVD呈负相关（rS=-0.613，P=0.00<0.05）。见图1-6（SABC×200）：
3讨论
细胞黏附是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动、发挥功能的调节因素，对细胞的增殖与分化有重要影响。细胞之间黏附结构功能改变使肿瘤易于脱离原发组织，侵袭转移。现已知的黏附结构包括4种连接形式：紧密连接、黏附带、缝隙连接和桥粒。紧密连接在极化上皮细胞的两个不同环境之间提供一个渗透屏障，在细胞层面上传递离子和小分子溶质，阻止潜在有害物质或病原体进入机体。紧密连接完整性的破坏可能是导致肿瘤细胞生长所需因子扩散的原因之一。Claudins作为构成紧密连接的主要骨架蛋白，通过蛋白激酶途径实现对细胞连接处选择渗透性的调节，其磷酸化后，干扰紧密连接的形成，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。
脑膜瘤虽是一种常见良性肿瘤，但少部分脑膜瘤仍会发生恶变，特别是多次复发或生长速度较快的脑膜瘤，其发生恶变的可能性相对较高。而某些部位如颅底、斜坡、脑室附近等发生的脑膜瘤因位置深在且毗邻重要组织结构，手术中不易做到全切[6]，术后较易复发，对放、化疗皆不敏感，所以深入了解脑膜瘤生物学行为、如何预防其增殖、复发成为目前研究的方向之一。 本实验结果显示claudin-3的表达在脑膜瘤组织中明显下调，提示其和脑膜瘤的发生、细胞增殖可能存在一定的关系，表达的缺失导致肿瘤细胞逃避凋亡，在肿瘤增殖、发展过程中发挥了一定的作用。换言之，其在脑膜瘤细胞中表达水平越低，该肿瘤发生率就越大，细胞增殖能力也越高。
在脑膜瘤发生、发展过程中具有重要意义的是血管生成和肿瘤细胞的不断增殖。本研究显示claudin-3在脑膜瘤中存在表达的下调，且它的阳性表达与MVD呈负相关。提示claudin-3与脑膜瘤的发生、发展、血管生成、细胞增殖、侵袭性等生物学行为存在着密切关系，有可能成为衡量脑膜瘤生物学行为、判断病情严重程度、推测脑膜瘤病理分级的敏感指标之一。而由于claudin-3在脑膜瘤细胞中的表达是下调、缺失的，所以如何转导或激活此类蛋白的基因、转录因子从而恢复细胞间正常紧密连接结构、减弱肿瘤细胞侵袭转移等问题可能成为今后的研究方向。
参考文献：
[1]郄明蓉，綦小蓉.卵巢交界性肿瘤的诊治进展[J].中华妇幼临床医学杂志：电子版，2012，8（4）：418-421.
[2]Chong Huat，Siar Syed Amjad，Abbas .Claudin expression and tight junction protein localization in the lining epithelium of the keratocystic odontogenic tumors，dentigerouscysts，and radicularcysts[J].Oral surgery，oral medicine，oral pathology and oral radiology，2013，115（5）：652-9.
[3]李燕，秦蓉，王玄，陈宗科.子宫颈上皮内瘤变进展过程中Claudin-1、3、4、7的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2013年29卷01期 49-52，57.
[4]Nemeth，Z Szasz，AM Tatrai，P Nemeth，J Gyorffy，H Somoracz，A Szijarto，A Kupcsulik，PKiss，ASchaff，Z[J].The Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2009，57（2）：113-121.
[5]李青，徐庆中主译.神经系统肿瘤病理学和遗传学[M].第3版，人民卫生出版社，2006：206～212.
[6]孙永强.颅底脑膜瘤术中处理[J].世界最新医学信息文摘，2013，13： 185-185，184.
关键词：脑膜瘤；紧密连接蛋白（claudin-3）；人类白血病相关细胞膜抗原（CD105）；血管生成；微血管密度（MVD）；免疫组化
脑膜瘤血运丰富，质地坚韧，新生血管多，在某些部位手术全切有一定困难，存在约为11%～12%的复发率。Claudins作为构成紧密连接的主要骨架蛋白，参与维持紧密连接的屏障功能和栅栏功能，进而影响细胞间的黏附能力，其磷酸化后，干扰紧密连接的形成，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。多项研究[1-4]证实Claudin-3在消化、生殖等多系统肿瘤中存在异常表达，提示Claudin-3可能在肿瘤的生物学特性上发挥作用。本研究拟采用免疫组化的方法对脑膜瘤中claudin-3的表达进行测定，以CD105抗体标记微血管测定微血管密度（MVD），观察claudin-3的表达强度与MVD以及新生血管生成的关系，分析紧密连接蛋白claudin-3在脑膜瘤中表达的意义，以期为脑膜瘤的诊疗、预防复发寻找新的思路和方法。
1 资料与方法
1.1一般资料
所有病例均经手术及病理检查证实，且病理诊断与临床资料完整的脑膜瘤患者，共计63例，其中男32例，年龄平均42.5±14岁；女31例，年龄平均43±13.3岁。病程1～84月，平均22.4+11.5月。另收集10例取自脑外伤手术病人的正常硬脑膜组织作对照。脑膜瘤病理标本按2006年颁布的WHO中枢神经系统肿瘤分型、分级标准分类[5]：I级30例（脑膜上皮型11例，纤维细胞型9例，沙粒型6例，混合型4例，）；II级21例（非典型性19例，透明细胞型脑膜瘤1例，脊索样型脑膜瘤1例）；Ⅲ级12例（间变型12例）。
1.2 研究方法
63例脑膜瘤标本作为研究组，10例正常脑膜标本为对照组。脑膜瘤标本Claudin-3、CD105免疫组化染色均按照试剂盒说明书采用SABC法规范操作。
1.3 结果判定
细胞胞浆出现黄色或棕褐色颗粒定义为claudin-3阳性表达，评分方法如下：阳性细胞染色强弱：阴性0分，着色弱但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者3分；阳性细胞的百分比：切片随机观察5个高倍视野，各计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。无阳性细胞者为0分，阳性细胞数小于25%者为1分，阳性细胞数占25%～50%者为2分，占51%～75%者为3分，﹥75%者为4分。上述两项相乘，0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。
血管内皮细胞膜和（或）细胞浆呈棕黄色或棕褐色着色定义为CD105蛋白染色阳性。凡被染成棕黄色或棕褐色的单个血管内皮细胞或细胞簇，只要其与邻近的微血管、肿瘤细胞或结缔组织成分有明显区别，就视为一个微血管而计数。低倍视野下确定新生血管形成最活跃的“热点”区域，再于高倍视野（×200倍）下计数。每张切片记录5个高倍视野下微血管数目（微血管切面数目），取其平均值作为该标本的MVD（个/视野）。
1.4 统计学处理
数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析：计量资料采用均数±标准差（ ±s）表示，率的比较采用LSD-t检验，χ2检验，两变量间相关性用Spearman等级相关分析。a=0.05。
2 结果
2.1 Claudin-3的表达与性别、年龄、肿瘤部位、大小差别无关。
2.2 免疫组化染色积分脑膜瘤组为7.00±2.38，低于对照组11.10±1.26，差异有统计学意义（P=0.000<0.05）。脑膜瘤组织中MVD的均值为38.44±10.74，对照组脑膜组织中MVD均值为3.60±1.05，明显低于肿瘤组织，差异有显著性（P=0.017 <0.05）。
2.3 对照组claudin-3的高表达者，MVD为3.6±1.05；脑膜瘤组中claudin-3的染色积分为1～4分者MVD为56.88±11.17，5～8分者MVD为35.43±4.14，9～12分者为MVD为28.30±3.94。在脑膜瘤组织中claudin-3阳性表达程度与MVD呈负相关（rS=-0.613，P=0.00<0.05）。见图1-6（SABC×200）：
3讨论
细胞黏附是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动、发挥功能的调节因素，对细胞的增殖与分化有重要影响。细胞之间黏附结构功能改变使肿瘤易于脱离原发组织，侵袭转移。现已知的黏附结构包括4种连接形式：紧密连接、黏附带、缝隙连接和桥粒。紧密连接在极化上皮细胞的两个不同环境之间提供一个渗透屏障，在细胞层面上传递离子和小分子溶质，阻止潜在有害物质或病原体进入机体。紧密连接完整性的破坏可能是导致肿瘤细胞生长所需因子扩散的原因之一。Claudins作为构成紧密连接的主要骨架蛋白，通过蛋白激酶途径实现对细胞连接处选择渗透性的调节，其磷酸化后，干扰紧密连接的形成，从而破坏细胞间紧密连接的正常功能。
脑膜瘤虽是一种常见良性肿瘤，但少部分脑膜瘤仍会发生恶变，特别是多次复发或生长速度较快的脑膜瘤，其发生恶变的可能性相对较高。而某些部位如颅底、斜坡、脑室附近等发生的脑膜瘤因位置深在且毗邻重要组织结构，手术中不易做到全切[6]，术后较易复发，对放、化疗皆不敏感，所以深入了解脑膜瘤生物学行为、如何预防其增殖、复发成为目前研究的方向之一。 本实验结果显示claudin-3的表达在脑膜瘤组织中明显下调，提示其和脑膜瘤的发生、细胞增殖可能存在一定的关系，表达的缺失导致肿瘤细胞逃避凋亡，在肿瘤增殖、发展过程中发挥了一定的作用。换言之，其在脑膜瘤细胞中表达水平越低，该肿瘤发生率就越大，细胞增殖能力也越高。
在脑膜瘤发生、发展过程中具有重要意义的是血管生成和肿瘤细胞的不断增殖。本研究显示claudin-3在脑膜瘤中存在表达的下调，且它的阳性表达与MVD呈负相关。提示claudin-3与脑膜瘤的发生、发展、血管生成、细胞增殖、侵袭性等生物学行为存在着密切关系，有可能成为衡量脑膜瘤生物学行为、判断病情严重程度、推测脑膜瘤病理分级的敏感指标之一。而由于claudin-3在脑膜瘤细胞中的表达是下调、缺失的，所以如何转导或激活此类蛋白的基因、转录因子从而恢复细胞间正常紧密连接结构、减弱肿瘤细胞侵袭转移等问题可能成为今后的研究方向。
参考文献：
[1]郄明蓉，綦小蓉.卵巢交界性肿瘤的诊治进展[J].中华妇幼临床医学杂志：电子版，2012，8（4）：418-421.
[2]Chong Huat，Siar Syed Amjad，Abbas .Claudin expression and tight junction protein localization in the lining epithelium of the keratocystic odontogenic tumors，dentigerouscysts，and radicularcysts[J].Oral surgery，oral medicine，oral pathology and oral radiology，2013，115（5）：652-9.
[3]李燕，秦蓉，王玄，陈宗科.子宫颈上皮内瘤变进展过程中Claudin-1、3、4、7的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2013年29卷01期 49-52，57.
[4]Nemeth，Z Szasz，AM Tatrai，P Nemeth，J Gyorffy，H Somoracz，A Szijarto，A Kupcsulik，PKiss，ASchaff，Z[J].The Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2009，57（2）：113-121.
[5]李青，徐庆中主译.神经系统肿瘤病理学和遗传学[M].第3版，人民卫生出版社，2006：206～212.
[6]孙永强.颅底脑膜瘤术中处理[J].世界最新医学信息文摘，2013，13： 185-185，184.