【摘 要】
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目的 克隆并分析乳酸菌LacZ基因,构建其原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,并纯化得到纯度较高的目的蛋白.方法 采用PCR方法从乳酸茸中扩增出LacZ基因,测序和序列分
【机 构】
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海南医学院生物技术专业实验室,海南,海口,571101;海南省人民医院药学部,海南,海口,570311
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目的 克隆并分析乳酸菌LacZ基因,构建其原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,并纯化得到纯度较高的目的蛋白.方法 采用PCR方法从乳酸茸中扩增出LacZ基因,测序和序列分析.将其克隆至克隆载体pGM-T vector中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ.以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定,最后通过纯化得到单一的目的蛋白.结果 PCR扩增获得3024bp的LacZ基因,测序得知序列与GeneBank报道的序列一致,序列分析表明,该序列开放读码框有3024bp,推测肤链具有1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4.9.构建了重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ,IPTG诱导其高效表达出融合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定出所表达蛋白的分子量为140KD.与融合蛋白的分子量一致.最后利用Glumthione Sepharose 4B对表达产物进行纯 化,得到单一的目的蛋白.结论 成功地构建了乳酸菌LacZ基因的原核表达质粒,通过序列分析并诱导表达,最后纯化得到单一的目的蛋白,为进一步生产低乳糖奶奠定基础.
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