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摘要：目的 优选冰荷洗剂最佳水提工艺条件。方法 采用正交试验，以绿原酸浸出量、浸膏得率为指标，用多指标综合评分法进行数据处理，优化提取条件。结果 最佳水提工艺为药材浸泡0.5 h，提取2次，加水量分别为10、8倍，提取时间分别为1.0、0.5 h。结论 该提取工艺合理，稳定可行。
关键词：冰荷洗剂；绿原酸；提取工艺；正交试验；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.022
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0056-03
冰荷洗剂是湘潭市中心医院朱湘生主任医师根据多年临床经验总结而成的经验方，由苦参、茵陈、黄柏、白鲜皮、薄荷、冰片等10味药组成，具有清热利湿、芳香化浊避秽、杀虫止痒功效，主要用于男性龟头炎的治疗，临床疗效达90%以上，且不良反应小[1-2]。但原制备工艺存在一些不合理现象，其制备方法为：将冰片、薄荷、青蒿、花椒等加水浸泡0.5 h后，煎药机煎煮2次，煎煮时间分别为1 h、40 min，合并煎液，过滤浓缩至每1 mL药液相当于1 g原药材量，10 mL/支，用温开水稀释即得。由于冰片具有挥发性，直接加水煎煮会导致冰片挥发；且处方中药味较多，苦参、黄柏等主要有效成分为生物碱类，而茵陈中主要抗菌成分为绿原酸[3]，生物碱类与有机酸类成分合煎，可能会导致有效成分发生反应生成难溶性盐而被过滤掉[4-5]。因此，本研究在对处方药味成分进行分析的基础上，为最大限度浸出有效成分、保证疗效，拟定茵陈、龙胆、花椒、薄荷四药用水煎煮，苦参、黄柏等其他药用乙醇提取，浓缩后再合并。为了优选其水提工艺条件，以方中茵陈主要有效成分绿原酸浸出量及浸膏得率作为评价指标，通过正交试验优选茵陈等药的水提工艺条件，为确定该制剂的水提工艺提供试验依据。
1 仪器与试药
Agilent1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AR11401C型电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；SK3300H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精弘实验设备有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精弘实验设备有限公司）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
绿原酸对照品（供含量测定用，批号060816，中国药品生物制品检定所提供）；所有药材均购自安徽协和成药业饮片有限公司；其中茵陈（产地：甘肃，批号100122）经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为本品为菊科植物茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分，按照2010年版《中华人民共和国药典》茵陈项下测定绿原酸含量为0.62%，符合规定[5]。乙腈（色譜纯，美国TEDIA天地试剂公司）；磷酸（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 绿原酸的含量测定
2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mmm， 5 ?m），以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）为流动相，检测波长为327 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量5 ?L，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于5 000[6]。在此条件下，绿原酸与其他组分均能达到较好分离。色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每44 ?g/mL的溶液，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 提取液上清液，用0.45 ?m微孔薄膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液各2、4、6、8、10 ?L注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以绿原酸进样（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程Y=3.1×106X-118 417，r=0.999 7，绿原酸在0.088～0.44 ?g范围内进样量与峰面积线性关系良好。
2.2 浸膏得率测定
精密移取提取液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算，即得。
2.3 提取次数考察
按处方比例，称取药材60 g，平行3份，加水浸泡1 h，加热回流提取3次，加水量分别为药材的8、6、6倍，提取时间分别为1.5、1、1 h。分别收集各次提取液，均定容至500 mL。分别按“2.1”、“2.2”项下方法测定绿原酸的含量与浸膏得率，并计算绿原酸转移率。结果见表1。可见，第3次提取液中，浸膏得率与绿原酸浸出量均比较低（分别占3次总量的9.13%与7.82%），故提取2次即可。
2.4 正交试验优选提取工艺
2.4.1 正交设计与试验方法 在水提次数确定的基础上，选择浸泡时间、加水量、提取时间作为考察因素，以浸膏得率及绿原酸浸出量作为评价指标，用L9（34）正交表安排试验。所选因素水平见表2。按处方比例称取药材60 g，共9份，依表3设计的方案加水提取，过滤，合并提取液，并定容至1 000 mL，然后按“2.1”、“2.2”项下方法测定绿原酸的含量与浸膏得率，并进行综合评分。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再根据各指标影响作用的大小，给出不同的权重进行数据统计分析。结果见表3，方差分析见表4。
2.4.2 试验结果 以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，各因素作用顺序为B（加水量）>A（浸泡时间）>C（提取时间），最优方案为A1B3C1。方差分析结果表明：因素A、B对试验结果均有显著影响（P<0.05）。综上，可确定水提工艺的最优条件为A1B3C1，即茵陈等药材加水浸泡0.5 h，加水量分别加10、8倍，提取时间分别为1、0.5 h。 2.4.3 验证试验 按处方比例称取茵陈等药材，共3份，按优选工艺进行提取验证。结果见表5。显示优选方案A1B3C1具有较好的重复性，表明此提取工艺条件稳定、可行。
3 讨论
正交试验优选的最佳条件是A1B3C1，而正交表中绿原酸含量最高的条件为A3B2C1，因此，试验中还对A1B3C1和A3B2C1进行了对比验证，结果A3B2C1工艺条件绿原酸的含量分别为175.2、177.3、176.8 mg（含量均低于178.77 mg），其平均值为176.43 mg，与优选的最佳条件A1B3C1的平均值176.79 mg没有显著差异。正交表中A3B2C1含量最高的原因可能是药材取样和测定误差所致。而方差分析结果也表明，A（浸泡时间）、B（加水量）均有显著影响，从节约能源角度考虑，确定水提工艺的最优条件A1B3C1，即药材浸泡0.5 h，提取2次，加水量分别为10、8倍，煎煮时间为1.0、0.5 h，经验证，工艺稳定、可行。
冰荷洗剂为复方制剂，方中药物成分复杂，考虑到绿原酸与处方中含生物碱（黄柏中小檗碱类）药味共煎时，可能会產生沉淀而影响有效成分的浸出，故将茵陈、龙胆、薄荷、花椒四药水煎提取。而绿原酸不稳定，容易发生变化，前期初步考察了茵陈与黄柏等含生物碱类药材单煎与共煎，发现共煎时绿原酸及盐酸小檗碱类成分转移率明显下降，而与处方中其他药味共煎时是否发生含量变化及变化情况将在后续工艺中继续研究。
参考文献：
[1] 谭育红，朱湘生，尹春辉，等.冰荷合剂治疗湿热证龟头炎临床观察[J].中国医药导报，2008，5（11）：110-111.
[2] 刘颖.冰荷合剂治疗念珠菌性龟头炎疗效护理观察[J].中国性科学， 2010，19（9）：21-23.
[3] 高锦明，张鞍灵，张康健，等.绿原酸分布、提取与生物活性研究[J].西北林学院学报，1999，14（2）：73-74.
[4] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用：第4卷[M].北京：学苑出版社，1998：3095.
[5] 张兆旺.中药药剂学：新世纪第2卷[M].北京：中国中医药出版社， 2007：515.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：223.
（收稿日期：2011-08-17，编辑：陈静）
关键词：冰荷洗剂；绿原酸；提取工艺；正交试验；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.03.022
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）03-0056-03
冰荷洗剂是湘潭市中心医院朱湘生主任医师根据多年临床经验总结而成的经验方，由苦参、茵陈、黄柏、白鲜皮、薄荷、冰片等10味药组成，具有清热利湿、芳香化浊避秽、杀虫止痒功效，主要用于男性龟头炎的治疗，临床疗效达90%以上，且不良反应小[1-2]。但原制备工艺存在一些不合理现象，其制备方法为：将冰片、薄荷、青蒿、花椒等加水浸泡0.5 h后，煎药机煎煮2次，煎煮时间分别为1 h、40 min，合并煎液，过滤浓缩至每1 mL药液相当于1 g原药材量，10 mL/支，用温开水稀释即得。由于冰片具有挥发性，直接加水煎煮会导致冰片挥发；且处方中药味较多，苦参、黄柏等主要有效成分为生物碱类，而茵陈中主要抗菌成分为绿原酸[3]，生物碱类与有机酸类成分合煎，可能会导致有效成分发生反应生成难溶性盐而被过滤掉[4-5]。因此，本研究在对处方药味成分进行分析的基础上，为最大限度浸出有效成分、保证疗效，拟定茵陈、龙胆、花椒、薄荷四药用水煎煮，苦参、黄柏等其他药用乙醇提取，浓缩后再合并。为了优选其水提工艺条件，以方中茵陈主要有效成分绿原酸浸出量及浸膏得率作为评价指标，通过正交试验优选茵陈等药的水提工艺条件，为确定该制剂的水提工艺提供试验依据。
1 仪器与试药
Agilent1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AR11401C型电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；SK3300H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精弘实验设备有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精弘实验设备有限公司）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
绿原酸对照品（供含量测定用，批号060816，中国药品生物制品检定所提供）；所有药材均购自安徽协和成药业饮片有限公司；其中茵陈（产地：甘肃，批号100122）经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为本品为菊科植物茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分，按照2010年版《中华人民共和国药典》茵陈项下测定绿原酸含量为0.62%，符合规定[5]。乙腈（色譜纯，美国TEDIA天地试剂公司）；磷酸（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 绿原酸的含量测定
2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mmm， 5 ?m），以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）为流动相，检测波长为327 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量5 ?L，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于5 000[6]。在此条件下，绿原酸与其他组分均能达到较好分离。色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每44 ?g/mL的溶液，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 提取液上清液，用0.45 ?m微孔薄膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液各2、4、6、8、10 ?L注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以绿原酸进样（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程Y=3.1×106X-118 417，r=0.999 7，绿原酸在0.088～0.44 ?g范围内进样量与峰面积线性关系良好。
2.2 浸膏得率测定
精密移取提取液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算，即得。
2.3 提取次数考察
按处方比例，称取药材60 g，平行3份，加水浸泡1 h，加热回流提取3次，加水量分别为药材的8、6、6倍，提取时间分别为1.5、1、1 h。分别收集各次提取液，均定容至500 mL。分别按“2.1”、“2.2”项下方法测定绿原酸的含量与浸膏得率，并计算绿原酸转移率。结果见表1。可见，第3次提取液中，浸膏得率与绿原酸浸出量均比较低（分别占3次总量的9.13%与7.82%），故提取2次即可。
2.4 正交试验优选提取工艺
2.4.1 正交设计与试验方法 在水提次数确定的基础上，选择浸泡时间、加水量、提取时间作为考察因素，以浸膏得率及绿原酸浸出量作为评价指标，用L9（34）正交表安排试验。所选因素水平见表2。按处方比例称取药材60 g，共9份，依表3设计的方案加水提取，过滤，合并提取液，并定容至1 000 mL，然后按“2.1”、“2.2”项下方法测定绿原酸的含量与浸膏得率，并进行综合评分。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再根据各指标影响作用的大小，给出不同的权重进行数据统计分析。结果见表3，方差分析见表4。
2.4.2 试验结果 以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，各因素作用顺序为B（加水量）>A（浸泡时间）>C（提取时间），最优方案为A1B3C1。方差分析结果表明：因素A、B对试验结果均有显著影响（P<0.05）。综上，可确定水提工艺的最优条件为A1B3C1，即茵陈等药材加水浸泡0.5 h，加水量分别加10、8倍，提取时间分别为1、0.5 h。 2.4.3 验证试验 按处方比例称取茵陈等药材，共3份，按优选工艺进行提取验证。结果见表5。显示优选方案A1B3C1具有较好的重复性，表明此提取工艺条件稳定、可行。
3 讨论
正交试验优选的最佳条件是A1B3C1，而正交表中绿原酸含量最高的条件为A3B2C1，因此，试验中还对A1B3C1和A3B2C1进行了对比验证，结果A3B2C1工艺条件绿原酸的含量分别为175.2、177.3、176.8 mg（含量均低于178.77 mg），其平均值为176.43 mg，与优选的最佳条件A1B3C1的平均值176.79 mg没有显著差异。正交表中A3B2C1含量最高的原因可能是药材取样和测定误差所致。而方差分析结果也表明，A（浸泡时间）、B（加水量）均有显著影响，从节约能源角度考虑，确定水提工艺的最优条件A1B3C1，即药材浸泡0.5 h，提取2次，加水量分别为10、8倍，煎煮时间为1.0、0.5 h，经验证，工艺稳定、可行。
冰荷洗剂为复方制剂，方中药物成分复杂，考虑到绿原酸与处方中含生物碱（黄柏中小檗碱类）药味共煎时，可能会產生沉淀而影响有效成分的浸出，故将茵陈、龙胆、薄荷、花椒四药水煎提取。而绿原酸不稳定，容易发生变化，前期初步考察了茵陈与黄柏等含生物碱类药材单煎与共煎，发现共煎时绿原酸及盐酸小檗碱类成分转移率明显下降，而与处方中其他药味共煎时是否发生含量变化及变化情况将在后续工艺中继续研究。
参考文献：
[1] 谭育红，朱湘生，尹春辉，等.冰荷合剂治疗湿热证龟头炎临床观察[J].中国医药导报，2008，5（11）：110-111.
[2] 刘颖.冰荷合剂治疗念珠菌性龟头炎疗效护理观察[J].中国性科学， 2010，19（9）：21-23.
[3] 高锦明，张鞍灵，张康健，等.绿原酸分布、提取与生物活性研究[J].西北林学院学报，1999，14（2）：73-74.
[4] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用：第4卷[M].北京：学苑出版社，1998：3095.
[5] 张兆旺.中药药剂学：新世纪第2卷[M].北京：中国中医药出版社， 2007：515.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：223.
（收稿日期：2011-08-17，编辑：陈静）