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摘要：以南苜蓿（Medicago polymorpha）为试验材料，用CTAB法提取南苜蓿基因组，选择已开发的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）引物100对，分别在一年生苜蓿SSR-PCR反应体系和苜蓿属变种SSR-PCR反应体系的基础上进行PCR扩增，并将扩增产物进行8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，都得到了位点明显、背景清晰的条带。结果表明，南苜蓿均适合于现有的一年生苜蓿SSR-PCR反应体系和苜蓿属变种SSR-PCR反应体系，建立了一套有效、成熟的应用于南苜蓿SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测的方法，该方法可以用于南苜蓿杂交F1代的鉴定以及后期资源的遗传分析。
关键词：南苜蓿；SSR标记；PAGE
中图分类号： S540.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0382-03
收稿日期：2014-11-10
基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2012340）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（编号：CXLX_1429）。
作者简介：陈祥（1990—），男，江苏扬州人，硕士研究生，研究方向为牧草种质资源评价与遗传育种。E-mail：yzdxchenxiang@163.com。
通信作者：魏臻武，博士，教授，主要从事牧草遗传育种与种质资源评价研究。E-mail：zhenwu_wei@hotmail.com。南苜蓿（Medicago polymorpha）属于豆科苜蓿属，是一年生或越年生苜蓿，别称秧草、草头、金花菜[1-2]、多形苜蓿[3]等。南苜蓿多产于长江中下游地区，如江苏、浙江等地，在安徽、江西、云南等地也有分布。南苜蓿常作为田间绿肥，也可作蔬菜和牧草。目前，随着秧草保健功能的不断彰显，多地已经形成了以秧草为主的产业。南苜蓿实现了牧草功能的延伸，是长三角生态农业新的增长点，成为我国南方草业发展的新亮点[4]。
简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR），是重复序列的重要组成部分。SSR是由1～6个核苷酸为重复单位序列组成的串联重复序列。SSR以PCR技术为基础，并均匀分布于整个基因组中。由于SSR分子标记具有共显性、涵盖范围广、标记数量丰富、所揭示的多态性高等优点[5]，已经在分子育种、指纹图谱构建、种子纯度鉴定、基因定位等方面得到广泛应用[6-7]。同样，对于遗传背景缺乏、没有测序信息的植物，SSR仍然具有极高的利用价值。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是一种以聚丙烯酰胺凝胶作为介质的常用电泳技术。由于其检测灵敏度和分辨率都比较高，是分子生物学和基因工程上不可缺少的试验技术，特别适合SSR标记扩增产物的检测[8-9]。本研究在张丽芳等模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）SSR标记的PCR反应体系[10]和Eujayl 等苜蓿属变种PCR反应体系[11]的基础上，建立一种适用于南苜蓿SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测的方法。
1材料与方法
1.1试验材料
本试验所用的南苜蓿材料由扬州大学草业科学研究所野外搜集所得（表1），于2014年4月种植于扬州大学扬子津校区实验地，在植株成型后取嫩叶研磨，提取的叶片DNA作为PCR反应的模板。试验所用的MgCl2、dNTP、Taq聚合酶试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2DNA提取
南苜蓿叶片基因组DNA提取采用魏臻武的CTAB法[12]。取10～15张叶片在液氮中迅速研磨成粉末，用于后续DNA的提取，提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量和浓度。样品稀释10倍放入4 ℃冰箱备用，原液放入-70 ℃冰箱长期保存。
1.3引物
引物来源于扬州大学草业科学研究所提供的100对蒺藜苜蓿SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物粉末用超纯水稀释，保证引物的浓度高于10 μmol/L。待完全溶解后在漩涡混合器中混匀，离心，放入-20 ℃冰箱中保存待用。
1.4PCR反应体系和扩增程序
SSR反应体系[10]为10 μL（每孔添加量）。10 μL PCR体系含0.24 μL dNTP （10 μmol/L），3 μL Primer（10 μmol/uL），0.16 μL Taq polymerase（1 U），1.5 μL 10×buffer （1 μmol/L），3 μL DNA 模板（20～90 ng/μL），0.9 μL Mg2 （20 mmol/L），1.2 μL ddH2O。
一年生苜蓿PCR扩增程序[13]：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，，55 ℃退火1.5 min （不同引物退火温度不同），72 ℃延伸1min，共循环35次；最后72 ℃保温8 min，4 ℃保存。
苜蓿属变种PCR扩增程序[11]：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s（不同引物退火温度不同），72 ℃延伸90 s，共循环40次；最后72 ℃保温10 min，4 ℃保存。
1.5PCR扩增产物的电泳检测
PCR扩增产物中加入l L loading buffer （溴酚蓝缓冲液），在8%非变性聚丙稀酰胺凝胶（PAGE）上，于100V电压电泳0.5 h，200 V电压电泳1 h，然后银染检测。
1.6图片处理
电泳照片用Adobe Photoshop CS2 9.0进行裁剪；引物信息采用Excel 2003整理。
2结果与分析 用100对蒺藜苜蓿SSR引物进行亲本母本温岭材料和父本楚雄材料及其杂交F1代多态性分析，筛选出8对多态性较好的作为南苜蓿特异性SSR引物，引物信息如表2所示。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，最后银染上色，其结果见图1、图2。
试验结果表明，蒺藜苜蓿SSR引物MtB152、MtB34、MtB147、MtB18、MtB21、MtB50、MtB16、MtB8在一年生苜蓿SSR-PCR反应体系中和苜蓿属变种SSR-PCR反应体系中均能扩增出条带，但条带质量有差异。具体表现为一年生苜蓿SSR反应体系扩增出的产物经电泳检测后得到的谱带要比苜蓿属变种的SSR反应体系扩增出的谱带背景更加清晰，多态性位点更易于辨认，但扩增出的位点明显少于苜蓿属变种SSR的反应体系。在2种反应体系中，引物MtB18、MtB147、MtB50、MtB8扩增出的条带数明显多于其他引物，多态性好于其他引物。
基于一年生苜蓿SSR反应体系和苜蓿属变种的SSR反应体系，分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳后对南苜蓿进行SSR标记检测，均能够得到稳定、易辨、背景清晰的谱带，是一套快速有效的检测方法。
3结论与讨论
由于SSR的诸多优点以及技术的日趋成熟，已经成为一种比较理想的分子标记技术，被广泛运用到多个领域。在农作物中，水稻（Oryza sativa）[14-15]、小麦（Triticum aestivum）[16-17]、玉米（Zea mays）[18]、大豆（Glycine max）[19]、大麦（Hordeum vulgare）[20]等都已进行了SSR标记的研究。
南苜蓿早期作为蔬菜和田间绿肥推广[4]，在分子生物学研究方面，还没有相关的文献报导，导致其遗传背景缺乏，试验工作无法借鉴，给遗传育种工作带来了困难。试验证明，根据南苜蓿的分类学地位，将其作为一年生苜蓿属植物的属性来研究，能够开展SSR分子标记的研究。根据引物之间的通用性，已开发的蒺藜苜蓿SSR引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在一年生苜蓿SSR-PCR反应体系和苜蓿属变种的SSR-PCR反应体系的基础之上，能够扩增出条带清晰、多态性高的谱带，可以用于南苜蓿试验分析与交流。
要想获得清晰可靠的条带可以改变引物的退火温度、Mg2 浓度以及反应的循环数[21-22]。基于一年生苜蓿SSR反应体系的谱带要比苜蓿属变种的SSR反应体系的清晰，但是扩增出的位点数要少于苜蓿属变种的反应体系，这可能与各自的反应体系的退火温度及循环次数有关，需要进一步设计试验来摸索证明，才能最终得到位点数多而且条带清晰可靠的SSR-PCR反应体系。
参考文献：
[1]王 栋.牧草学各论[M]. 南京：畜牧兽医图书出版社，1956：170-171.
[2]陈默君，贾慎修. 中国饲用植物[M]. 北京：中国农业出版社，2002：579-580.
[3]南苜蓿[EB/OL]. [2014-10-02]. http：//www.eflora.cn/sp/Medicago polymorpha#map.
[4]曹德明，魏臻武，虞珍萍，等. 扬中金花菜产业发展新模式——南方草业的新亮点[J]. 草原与草坪，2012（5）：79-82.
[5]徐兴兴，梁海永，甄志先，等. 苹果SSR反应体系的建立[J]. 果树学报，2006，23（2）：161-164.
[6]Cook D R. Medicago truncatula—a model in the making！[J]. Current Opinion in Plant Biology，1999，2（4）：301-304.
[7]常金华，夏雪岩，张丽，等. 高粱抗蚜基因的遗传分析和SSR标记定位[J]. 草业学报，2006，15（2）：113-118.
[8]宋显军，张伟，曹萍，等. 大豆SSR标记PAGE银染方法的改进[J]. 安徽农业科学，2006，34（16）：3922-3923.
[9]张芳，权军利，单卫星. 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测致病疫霉菌SSR标记方法改良[J]. 安徽农业科学，2011，39（27）：16606-16607.
[10]张丽芳，魏臻武，杨占花. 蒺藜苜蓿SSR反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用[J]. 草地学报，2007，15（5）：429-436.
[11]Eujayl I，Sledge M K，Wang L，et al. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for Medicago spp.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（3）：414-422.
[12]魏臻武. 利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱[J]. 草业学报，2004，13（3）：62-67.
[13]屠德鹏，魏臻武，武自念，等. 蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及标记的开发[J]. 草业科学，2011，28（5）：746-752.
[14]Wu K S，Tanksley S D. Abundance，polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice[J]. Molecular
关键词：南苜蓿；SSR标记；PAGE
中图分类号： S540.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0382-03
收稿日期：2014-11-10
基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2012340）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（编号：CXLX_1429）。
作者简介：陈祥（1990—），男，江苏扬州人，硕士研究生，研究方向为牧草种质资源评价与遗传育种。E-mail：yzdxchenxiang@163.com。
通信作者：魏臻武，博士，教授，主要从事牧草遗传育种与种质资源评价研究。E-mail：zhenwu_wei@hotmail.com。南苜蓿（Medicago polymorpha）属于豆科苜蓿属，是一年生或越年生苜蓿，别称秧草、草头、金花菜[1-2]、多形苜蓿[3]等。南苜蓿多产于长江中下游地区，如江苏、浙江等地，在安徽、江西、云南等地也有分布。南苜蓿常作为田间绿肥，也可作蔬菜和牧草。目前，随着秧草保健功能的不断彰显，多地已经形成了以秧草为主的产业。南苜蓿实现了牧草功能的延伸，是长三角生态农业新的增长点，成为我国南方草业发展的新亮点[4]。
简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR），是重复序列的重要组成部分。SSR是由1～6个核苷酸为重复单位序列组成的串联重复序列。SSR以PCR技术为基础，并均匀分布于整个基因组中。由于SSR分子标记具有共显性、涵盖范围广、标记数量丰富、所揭示的多态性高等优点[5]，已经在分子育种、指纹图谱构建、种子纯度鉴定、基因定位等方面得到广泛应用[6-7]。同样，对于遗传背景缺乏、没有测序信息的植物，SSR仍然具有极高的利用价值。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是一种以聚丙烯酰胺凝胶作为介质的常用电泳技术。由于其检测灵敏度和分辨率都比较高，是分子生物学和基因工程上不可缺少的试验技术，特别适合SSR标记扩增产物的检测[8-9]。本研究在张丽芳等模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）SSR标记的PCR反应体系[10]和Eujayl 等苜蓿属变种PCR反应体系[11]的基础上，建立一种适用于南苜蓿SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测的方法。
1材料与方法
1.1试验材料
本试验所用的南苜蓿材料由扬州大学草业科学研究所野外搜集所得（表1），于2014年4月种植于扬州大学扬子津校区实验地，在植株成型后取嫩叶研磨，提取的叶片DNA作为PCR反应的模板。试验所用的MgCl2、dNTP、Taq聚合酶试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2DNA提取
南苜蓿叶片基因组DNA提取采用魏臻武的CTAB法[12]。取10～15张叶片在液氮中迅速研磨成粉末，用于后续DNA的提取，提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量和浓度。样品稀释10倍放入4 ℃冰箱备用，原液放入-70 ℃冰箱长期保存。
1.3引物
引物来源于扬州大学草业科学研究所提供的100对蒺藜苜蓿SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物粉末用超纯水稀释，保证引物的浓度高于10 μmol/L。待完全溶解后在漩涡混合器中混匀，离心，放入-20 ℃冰箱中保存待用。
1.4PCR反应体系和扩增程序
SSR反应体系[10]为10 μL（每孔添加量）。10 μL PCR体系含0.24 μL dNTP （10 μmol/L），3 μL Primer（10 μmol/uL），0.16 μL Taq polymerase（1 U），1.5 μL 10×buffer （1 μmol/L），3 μL DNA 模板（20～90 ng/μL），0.9 μL Mg2 （20 mmol/L），1.2 μL ddH2O。
一年生苜蓿PCR扩增程序[13]：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，，55 ℃退火1.5 min （不同引物退火温度不同），72 ℃延伸1min，共循环35次；最后72 ℃保温8 min，4 ℃保存。
苜蓿属变种PCR扩增程序[11]：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s（不同引物退火温度不同），72 ℃延伸90 s，共循环40次；最后72 ℃保温10 min，4 ℃保存。
1.5PCR扩增产物的电泳检测
PCR扩增产物中加入l L loading buffer （溴酚蓝缓冲液），在8%非变性聚丙稀酰胺凝胶（PAGE）上，于100V电压电泳0.5 h，200 V电压电泳1 h，然后银染检测。
1.6图片处理
电泳照片用Adobe Photoshop CS2 9.0进行裁剪；引物信息采用Excel 2003整理。
2结果与分析 用100对蒺藜苜蓿SSR引物进行亲本母本温岭材料和父本楚雄材料及其杂交F1代多态性分析，筛选出8对多态性较好的作为南苜蓿特异性SSR引物，引物信息如表2所示。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，最后银染上色，其结果见图1、图2。
试验结果表明，蒺藜苜蓿SSR引物MtB152、MtB34、MtB147、MtB18、MtB21、MtB50、MtB16、MtB8在一年生苜蓿SSR-PCR反应体系中和苜蓿属变种SSR-PCR反应体系中均能扩增出条带，但条带质量有差异。具体表现为一年生苜蓿SSR反应体系扩增出的产物经电泳检测后得到的谱带要比苜蓿属变种的SSR反应体系扩增出的谱带背景更加清晰，多态性位点更易于辨认，但扩增出的位点明显少于苜蓿属变种SSR的反应体系。在2种反应体系中，引物MtB18、MtB147、MtB50、MtB8扩增出的条带数明显多于其他引物，多态性好于其他引物。
基于一年生苜蓿SSR反应体系和苜蓿属变种的SSR反应体系，分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳后对南苜蓿进行SSR标记检测，均能够得到稳定、易辨、背景清晰的谱带，是一套快速有效的检测方法。
3结论与讨论
由于SSR的诸多优点以及技术的日趋成熟，已经成为一种比较理想的分子标记技术，被广泛运用到多个领域。在农作物中，水稻（Oryza sativa）[14-15]、小麦（Triticum aestivum）[16-17]、玉米（Zea mays）[18]、大豆（Glycine max）[19]、大麦（Hordeum vulgare）[20]等都已进行了SSR标记的研究。
南苜蓿早期作为蔬菜和田间绿肥推广[4]，在分子生物学研究方面，还没有相关的文献报导，导致其遗传背景缺乏，试验工作无法借鉴，给遗传育种工作带来了困难。试验证明，根据南苜蓿的分类学地位，将其作为一年生苜蓿属植物的属性来研究，能够开展SSR分子标记的研究。根据引物之间的通用性，已开发的蒺藜苜蓿SSR引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在一年生苜蓿SSR-PCR反应体系和苜蓿属变种的SSR-PCR反应体系的基础之上，能够扩增出条带清晰、多态性高的谱带，可以用于南苜蓿试验分析与交流。
要想获得清晰可靠的条带可以改变引物的退火温度、Mg2 浓度以及反应的循环数[21-22]。基于一年生苜蓿SSR反应体系的谱带要比苜蓿属变种的SSR反应体系的清晰，但是扩增出的位点数要少于苜蓿属变种的反应体系，这可能与各自的反应体系的退火温度及循环次数有关，需要进一步设计试验来摸索证明，才能最终得到位点数多而且条带清晰可靠的SSR-PCR反应体系。
参考文献：
[1]王 栋.牧草学各论[M]. 南京：畜牧兽医图书出版社，1956：170-171.
[2]陈默君，贾慎修. 中国饲用植物[M]. 北京：中国农业出版社，2002：579-580.
[3]南苜蓿[EB/OL]. [2014-10-02]. http：//www.eflora.cn/sp/Medicago polymorpha#map.
[4]曹德明，魏臻武，虞珍萍，等. 扬中金花菜产业发展新模式——南方草业的新亮点[J]. 草原与草坪，2012（5）：79-82.
[5]徐兴兴，梁海永，甄志先，等. 苹果SSR反应体系的建立[J]. 果树学报，2006，23（2）：161-164.
[6]Cook D R. Medicago truncatula—a model in the making！[J]. Current Opinion in Plant Biology，1999，2（4）：301-304.
[7]常金华，夏雪岩，张丽，等. 高粱抗蚜基因的遗传分析和SSR标记定位[J]. 草业学报，2006，15（2）：113-118.
[8]宋显军，张伟，曹萍，等. 大豆SSR标记PAGE银染方法的改进[J]. 安徽农业科学，2006，34（16）：3922-3923.
[9]张芳，权军利，单卫星. 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测致病疫霉菌SSR标记方法改良[J]. 安徽农业科学，2011，39（27）：16606-16607.
[10]张丽芳，魏臻武，杨占花. 蒺藜苜蓿SSR反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用[J]. 草地学报，2007，15（5）：429-436.
[11]Eujayl I，Sledge M K，Wang L，et al. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for Medicago spp.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（3）：414-422.
[12]魏臻武. 利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱[J]. 草业学报，2004，13（3）：62-67.
[13]屠德鹏，魏臻武，武自念，等. 蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及标记的开发[J]. 草业科学，2011，28（5）：746-752.
[14]Wu K S，Tanksley S D. Abundance，polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice[J]. Molecular