【摘 要】
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目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体.方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克
【机 构】
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中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃,兰州,730046
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目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体.方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEM T-easy载体相连构建pGEM/β3LBD,经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白.纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体.通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性.结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、92.3%、92.1%、91.3%、90.5%、90.3%、87.8%、85.2%、79.5%.哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低.实现了重组猪β3 LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44 000,制备的兔多克隆抗体效价达1:12800以上.结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础.
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