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[摘要] 目的 考察广西14个产地的16份何首乌药材样品中蒽醌的含量，科学地评价广西产何首乌的质量。 方法 采用HPLC法测定，色谱柱：symmetryC18（4.6 mm× 150 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（84∶16），流速1 mL/min，检测波长254 nm。 结果 不同产地的何首乌药材蒽醌的含量差别很大。 结论 广西产何首乌质量存在较大差异，研究结果为全面评价广西何首乌药材质量优劣有指导意义。
[关键词] 何首乌；蒽醌；含量测定
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2011）22-28-03
Determination of anthraquinone in Radix Polygoni multiflori from different regions of Guangxi
HUANG Quanfang WU Xiaoyan WEI Zhenyuan ZENG Chao
The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning 530023,China
[Abstract] Objective The anthraquinone content of 16 Polygonum multiflorum samples,which from 14 different regions of Guangxi Province,were determined. Methods HPLC conditions:A symmetry C18 column,the mixture of methanol-0.1% orthophosphoric acid(84∶16)as mobilephase for determining Anthraquinone,UV detection at 254 nm. Results The result showed the difference of the anthraquinone content in these samples are obvious. Conclusion The quality of the medicinal materials from Polygonum multiflorum in differert regions are not similar,which have a guide purport on reliablere cognizing and estimating the quality of Polygonum multiflorum of Guangxi.
[Key words] Polygonum multiflorum;Anthraquinone;Determination
何首乌药材的质量因不同产地有效含量差别较大，可直接影响其临床疗效。甚至一度认为广西产何首乌与传统的何首乌药材的云锦状花纹不一致，木心偏大，不宜入药[1]。多年来笔者所在课题组对广西何首乌一直进行调查研究，本地产何首乌的小枝有两种形态特征，一种为产自平乐、宾阳、桂林、恭城的圆形小枝称圆茎何首乌，如拳头大，根具五棱瓣，断面棱脊处多为一轮“云锦状花纹”，这与传统的何首乌药材相近；另一种桂西、桂西北产方形小枝的方茎何首乌皮部散在多数云锦状花纹，多形成数轮，中央木部较大，呈一木心，质量不佳[2]。以二苯乙烯苷为质控指标，对广西不同产地何首乌进行含量测定，笔者发现不同产地的何首乌中二苯乙烯苷的含量差别很大，最高含量和最低含量差距很大，分别为6.06%和0.04%，其中二苯乙烯苷的含量较高的产地以平乐县、宾阳县、恭城县、桂林市等地居多[3]。为进一步客观、科学地评价广西何首乌的质量，笔者又对广西不同产地何首乌蒽醌类成分的含量进行综合考察，现报道如下。
1 仪器及试药
1.1 仪器
Waters高效液相色谱系统（Waters1525并联泵，Waters2487双波长紫外检测器，Waters Breeze色谱工作站）。
1.2 试药
大黄素（批号：110756-200110），大黄素甲醚（批号：10758-
200408），大黄酚（批号：110796-200310），大黄酸（批号：0757-200206）均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。溶剂均为分析纯，流动相为色谱纯。在广西14个产地采集得到何首乌共16份样品，分别经过广西中医学院林安平副教授鉴定后认为16份样品均为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum的块根。经烘干后粉碎，过60目筛，于60℃干燥至恒重后置干燥器中备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[5]
色谱柱选用symmetry C18（4.6 mm×150mm，5 μm），柱温控制在室温，流动相：甲醇-0.1%磷酸（84∶16），流速保持在1 mL/min，设定检测波长为254 nm，进样量10 μL。上述色谱条件可供大黄素和大黄素甲醚的分析。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取1.1 mg大黄素、1.4 mg大黄素甲醚对照品，2.2 mg大黄酚，1.1 mg大黄酸，分别用甲醇超声振荡溶解并定容于5 mL容量瓶中，各样品浓度分别为：大黄素对照品溶液0.220 mg/mL、大黄素甲醚对照品溶液0.280 mg/mL、大黄酚对照品溶液0.440 mg/mL、大黄酸对照品溶液0.220 mg/mL。
2.3 供试品溶液的制备[6]
精密称定约0.5 g的样品粉末，置于索氏提取器中，并加入50 mL氯仿进行约2 h的回流提取，待到氯仿液在索氏提取器中变为无色（经检查蒽醌已提取完全）。氯仿液回收溶剂，用甲醇将残留物溶解后转移到2.5 mL容量瓶中并定容至刻度，作为游离蒽醌的供试品溶液。药渣经氯仿提取后，用甲醇50 mL继续回流2 h用以提取结合型蒽醌，将回收后的甲醇液加入4 mL硫酸溶液（10%）和25 mL氯仿，经过沸水浴4ｈ回流水解；置于分液漏斗中分取水解液的氯仿层，水层分3次用30 mL的氯仿萃取，合并氯仿液，水洗至pH约为 6.0；回收氯仿，甲醇溶解剩余残留物并定溶于5 mL容量瓶中至刻度，作为结合蒽醌的供试品溶液。
2.4 系统适用性试验
各取0.2 mL对照品溶液混合，作为混合对照品溶液。向色谱仪分别注入供试品溶液、混合对照品溶液，空白对照品用甲醇，记录各试样的色谱图。见图1。
图A：蒽醌对照品（1：大黄酸；2：大黄素；3：大黄酚；
4：大黄素甲醚）；图B：样品；图C：空白对照
图1 蒽醌类对照品与样品高效液相色谱图
对照品中各物质的保留时间分别为：大黄酸3.924 min，大黄酚为7.576 min，大黄素为5.381 min，大黄素甲醚为10.576 min。以大黄素计算理论塔板数5 000以上，对称因子0.96，峰面积重现性RSD=0.7%（n=6）。供试液中大黄素、大黄素甲醚的保留时间分别为5.630 min和10.866 min，峰面积重现性RSD=1.7%（n=6），两峰之间分离度＞1.5。
2.5 线性关系考察
精密吸取大黄素对照品溶液进行梯度稀释，各浓度分别为220.00、110.00、55.00、27.50、13.75、6.88、3.44μg/mL。分别吸取10 μL对照品液进样，记录色谱图，测定峰面积值仍采用上述色谱条件，纵坐标（Y）：峰面积积分值，横坐标（X）：对照品进样浓度（μg/mL），线性回归处理后得回归方程Y=773.06X+321.86，r=0.999 9（n=7）。见图2。由图可见，对照品量与色谱峰面积积分值在样品浓度为3.44～220.00 μg/mL时呈良好线性关系。
图2 大黄素标准曲线图
同上大黄素的测定方式，精密吸取大黄素甲醚对照品液对其梯度稀释，各浓度为280.00、140.00、70.00、35.00、17.50、8.75、4.38μg/mL。分别吸取10 μL对照品液进样，记录色谱图，测定峰面积值仍采用上述色谱条件，纵坐标（Y）：峰面积积分值，横坐标（X）：对照品进样浓度（μg/mL），得回归方程Y=304.34X+3673.8，r=0.999 8（n=7）。见图3。由图可见，对照品量与色谱峰面积积分值在样品浓度为4.38～280.00 μg/mL时呈良好线性关系。
图3 大黄素甲醚标准曲线图
2.6 稳定性试验
取蒽醌混合对照品溶液，进样10 μL，重复5次，记录峰面积，各组分峰面积的RSD为0.8%～2.0%。
2.7 重复性试验
按上述蒽醌供试品溶液的制备方法，制备同一产地的5份供试品溶液，测定以上述色谱条件为准，经计算得各组分含量的RSD=2.5%（n=5）。
2.8 回收率试验
取同一产地样品，精密加入不同体积上述两种对照品原溶液（1 mL约相当于含大黄素220 μg，大黄素甲醚280 μg）混合，按样品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，测定以上述色谱条件为准，加入量计算，回收率结果见表1。
表1 大黄素、大黄素甲醚回收率试验结果（n=6）
编号 原含量（mg/g） 加入量（μg） 测得量（μg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）
1 1.93
55.0 50.0 95.9 95.5
0.95
2 55.9 95.3
3 110.0 100.0 96.3
4 99.3 94.5
5 220.0 210.3 94.6
6 225.5 94.5
1 0.92
35.0 35.5 96.3 95.2
1.16
2 34.0 96.4
3 70.0 69.7 94.3
4 70.1 93.9
5 140.0 136.5 95.1
6 139.8 95.0
表2 样品中大黄素、大黄素甲醚及总蒽醌平均含量的测定结果（mg/g，n=3）
产地 大黄素 大黄素甲醚 总蒽醌 产地 大黄素 大黄素甲醚 总蒽醌
大新县 0.90 0.37 1.27 田阳县 0.00 0.00 0.00
宾阳县 2.10 0.78 2.88 东兰县 0.23 0.12 0.34
平乐县 2.07 1.22 3.29 河池市2 0.00 0.00 0.00
忻城县 0.46 0.41 0.87 那坡县 0.18 0.09 0.27
桂林市 2.08 0.80 2.88 河池市1 0.01 0.00 0.01
恭城县 1.96 0.44 2.40 河池市3 0.02 0.00 0.02
龙州县 0.98 0.44 1.42 田林县 0.00 0.00 0.00
靖西县 1.10 0.40 1.50 凌云县 0.00 0.00 0.00
2.9 样品测定
依上述方法制备采集到的各种何首乌的样品溶液，HPLC法按照上述条件进行测定，检测结果见表2。
3 讨论
对广西14个产地的16份何首乌药材样品中蒽醌的含量测定结果表明，不同产地的何首乌中大黄素及大黄素甲醚含量差异较大，分别为总大黄素在0.00～2.39 mg/g，总大黄素甲醚在0.00～1.34 mg/g。大黄素甲醚的含量在统一何首乌样品中要较大黄素的含量低。另外，通过本次试验研究，分析出大黄素、大黄素甲醚及二苯乙烯苷在广西产的何首乌中的含量与其二苯乙烯苷的含量成正比关系，即样品的蒽醌类化合物含量高，其二苯乙烯苷的含量也高，这一结果也符合前期实验结果，其中，蒽醌类化合物和二苯乙烯苷两者是否具有相伴生，这一问题值得进一步深入研究。此外，不论从药材性状[1]、主要化学成分（蒽醌类成分、二苯乙烯苷）来看，广西平乐县、恭城县、桂林市、宾阳县等地所产何首乌药材质量较符合药典入药要求，而桂西地区一些县市所产何首乌生药性状及成分含量相对于药典则有一定的差距。
本研究结果显示，在相同的采收季节、以相同的方法加工处理的何首乌Polygonum multiflorum块根，广西不同产地其性状、主要化学成分含量存在较大差异，这可能与各地气候、土壤等环境条件有关。有必要对何首乌生长环境及有效成分进行系统研究，总结出广西何首乌的最佳生长条件，为何首乌的规范化栽培提供科学依据。
此外，要加快应用现代科学技术手段开展对何首乌植物功能成分及其药效学研究与开发的步伐，更多的研究要集中在何首乌使用的基础上，运用现代科技手段对其植物的功能成分进行检测分析，开展药效学研究，并广泛应用于中医临床和相关产品开发。
[参考文献]
[1] 肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2001：518.
[2] 黄权芳，朱华，周燕华，等.两种广西产何首乌的形态组织鉴定[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1466-1467.
[3] 严寒静，傅军，梁从庆，等.不同采集地何首乌中蒽醌类成分的含量测定[J].中成药，2007，29（7）：1023-1026.
[4] 朱华，黄权芳，周燕华，等.HPLC法测定广西不同产地何首乌中二苯乙烯苷的含量[J].广西中医药，2006，29（6）：52-54.
[5] 刘燕，晁若冰.HPLC同时测定不同何首乌中的两种蒽醌类成分[J].华西药学杂志，2009，24（3）：285-287.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2005-5-14.
（收稿日期：2011-09-22）
[关键词] 何首乌；蒽醌；含量测定
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2011）22-28-03
Determination of anthraquinone in Radix Polygoni multiflori from different regions of Guangxi
HUANG Quanfang WU Xiaoyan WEI Zhenyuan ZENG Chao
The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning 530023,China
[Abstract] Objective The anthraquinone content of 16 Polygonum multiflorum samples,which from 14 different regions of Guangxi Province,were determined. Methods HPLC conditions:A symmetry C18 column,the mixture of methanol-0.1% orthophosphoric acid(84∶16)as mobilephase for determining Anthraquinone,UV detection at 254 nm. Results The result showed the difference of the anthraquinone content in these samples are obvious. Conclusion The quality of the medicinal materials from Polygonum multiflorum in differert regions are not similar,which have a guide purport on reliablere cognizing and estimating the quality of Polygonum multiflorum of Guangxi.
[Key words] Polygonum multiflorum;Anthraquinone;Determination
何首乌药材的质量因不同产地有效含量差别较大，可直接影响其临床疗效。甚至一度认为广西产何首乌与传统的何首乌药材的云锦状花纹不一致，木心偏大，不宜入药[1]。多年来笔者所在课题组对广西何首乌一直进行调查研究，本地产何首乌的小枝有两种形态特征，一种为产自平乐、宾阳、桂林、恭城的圆形小枝称圆茎何首乌，如拳头大，根具五棱瓣，断面棱脊处多为一轮“云锦状花纹”，这与传统的何首乌药材相近；另一种桂西、桂西北产方形小枝的方茎何首乌皮部散在多数云锦状花纹，多形成数轮，中央木部较大，呈一木心，质量不佳[2]。以二苯乙烯苷为质控指标，对广西不同产地何首乌进行含量测定，笔者发现不同产地的何首乌中二苯乙烯苷的含量差别很大，最高含量和最低含量差距很大，分别为6.06%和0.04%，其中二苯乙烯苷的含量较高的产地以平乐县、宾阳县、恭城县、桂林市等地居多[3]。为进一步客观、科学地评价广西何首乌的质量，笔者又对广西不同产地何首乌蒽醌类成分的含量进行综合考察，现报道如下。
1 仪器及试药
1.1 仪器
Waters高效液相色谱系统（Waters1525并联泵，Waters2487双波长紫外检测器，Waters Breeze色谱工作站）。
1.2 试药
大黄素（批号：110756-200110），大黄素甲醚（批号：10758-
200408），大黄酚（批号：110796-200310），大黄酸（批号：0757-200206）均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。溶剂均为分析纯，流动相为色谱纯。在广西14个产地采集得到何首乌共16份样品，分别经过广西中医学院林安平副教授鉴定后认为16份样品均为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum的块根。经烘干后粉碎，过60目筛，于60℃干燥至恒重后置干燥器中备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[5]
色谱柱选用symmetry C18（4.6 mm×150mm，5 μm），柱温控制在室温，流动相：甲醇-0.1%磷酸（84∶16），流速保持在1 mL/min，设定检测波长为254 nm，进样量10 μL。上述色谱条件可供大黄素和大黄素甲醚的分析。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取1.1 mg大黄素、1.4 mg大黄素甲醚对照品，2.2 mg大黄酚，1.1 mg大黄酸，分别用甲醇超声振荡溶解并定容于5 mL容量瓶中，各样品浓度分别为：大黄素对照品溶液0.220 mg/mL、大黄素甲醚对照品溶液0.280 mg/mL、大黄酚对照品溶液0.440 mg/mL、大黄酸对照品溶液0.220 mg/mL。
2.3 供试品溶液的制备[6]
精密称定约0.5 g的样品粉末，置于索氏提取器中，并加入50 mL氯仿进行约2 h的回流提取，待到氯仿液在索氏提取器中变为无色（经检查蒽醌已提取完全）。氯仿液回收溶剂，用甲醇将残留物溶解后转移到2.5 mL容量瓶中并定容至刻度，作为游离蒽醌的供试品溶液。药渣经氯仿提取后，用甲醇50 mL继续回流2 h用以提取结合型蒽醌，将回收后的甲醇液加入4 mL硫酸溶液（10%）和25 mL氯仿，经过沸水浴4ｈ回流水解；置于分液漏斗中分取水解液的氯仿层，水层分3次用30 mL的氯仿萃取，合并氯仿液，水洗至pH约为 6.0；回收氯仿，甲醇溶解剩余残留物并定溶于5 mL容量瓶中至刻度，作为结合蒽醌的供试品溶液。
2.4 系统适用性试验
各取0.2 mL对照品溶液混合，作为混合对照品溶液。向色谱仪分别注入供试品溶液、混合对照品溶液，空白对照品用甲醇，记录各试样的色谱图。见图1。
图A：蒽醌对照品（1：大黄酸；2：大黄素；3：大黄酚；
4：大黄素甲醚）；图B：样品；图C：空白对照
图1 蒽醌类对照品与样品高效液相色谱图
对照品中各物质的保留时间分别为：大黄酸3.924 min，大黄酚为7.576 min，大黄素为5.381 min，大黄素甲醚为10.576 min。以大黄素计算理论塔板数5 000以上，对称因子0.96，峰面积重现性RSD=0.7%（n=6）。供试液中大黄素、大黄素甲醚的保留时间分别为5.630 min和10.866 min，峰面积重现性RSD=1.7%（n=6），两峰之间分离度＞1.5。
2.5 线性关系考察
精密吸取大黄素对照品溶液进行梯度稀释，各浓度分别为220.00、110.00、55.00、27.50、13.75、6.88、3.44μg/mL。分别吸取10 μL对照品液进样，记录色谱图，测定峰面积值仍采用上述色谱条件，纵坐标（Y）：峰面积积分值，横坐标（X）：对照品进样浓度（μg/mL），线性回归处理后得回归方程Y=773.06X+321.86，r=0.999 9（n=7）。见图2。由图可见，对照品量与色谱峰面积积分值在样品浓度为3.44～220.00 μg/mL时呈良好线性关系。
图2 大黄素标准曲线图
同上大黄素的测定方式，精密吸取大黄素甲醚对照品液对其梯度稀释，各浓度为280.00、140.00、70.00、35.00、17.50、8.75、4.38μg/mL。分别吸取10 μL对照品液进样，记录色谱图，测定峰面积值仍采用上述色谱条件，纵坐标（Y）：峰面积积分值，横坐标（X）：对照品进样浓度（μg/mL），得回归方程Y=304.34X+3673.8，r=0.999 8（n=7）。见图3。由图可见，对照品量与色谱峰面积积分值在样品浓度为4.38～280.00 μg/mL时呈良好线性关系。
图3 大黄素甲醚标准曲线图
2.6 稳定性试验
取蒽醌混合对照品溶液，进样10 μL，重复5次，记录峰面积，各组分峰面积的RSD为0.8%～2.0%。
2.7 重复性试验
按上述蒽醌供试品溶液的制备方法，制备同一产地的5份供试品溶液，测定以上述色谱条件为准，经计算得各组分含量的RSD=2.5%（n=5）。
2.8 回收率试验
取同一产地样品，精密加入不同体积上述两种对照品原溶液（1 mL约相当于含大黄素220 μg，大黄素甲醚280 μg）混合，按样品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，测定以上述色谱条件为准，加入量计算，回收率结果见表1。
表1 大黄素、大黄素甲醚回收率试验结果（n=6）
编号 原含量（mg/g） 加入量（μg） 测得量（μg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）
1 1.93
55.0 50.0 95.9 95.5
0.95
2 55.9 95.3
3 110.0 100.0 96.3
4 99.3 94.5
5 220.0 210.3 94.6
6 225.5 94.5
1 0.92
35.0 35.5 96.3 95.2
1.16
2 34.0 96.4
3 70.0 69.7 94.3
4 70.1 93.9
5 140.0 136.5 95.1
6 139.8 95.0
表2 样品中大黄素、大黄素甲醚及总蒽醌平均含量的测定结果（mg/g，n=3）
产地 大黄素 大黄素甲醚 总蒽醌 产地 大黄素 大黄素甲醚 总蒽醌
大新县 0.90 0.37 1.27 田阳县 0.00 0.00 0.00
宾阳县 2.10 0.78 2.88 东兰县 0.23 0.12 0.34
平乐县 2.07 1.22 3.29 河池市2 0.00 0.00 0.00
忻城县 0.46 0.41 0.87 那坡县 0.18 0.09 0.27
桂林市 2.08 0.80 2.88 河池市1 0.01 0.00 0.01
恭城县 1.96 0.44 2.40 河池市3 0.02 0.00 0.02
龙州县 0.98 0.44 1.42 田林县 0.00 0.00 0.00
靖西县 1.10 0.40 1.50 凌云县 0.00 0.00 0.00
2.9 样品测定
依上述方法制备采集到的各种何首乌的样品溶液，HPLC法按照上述条件进行测定，检测结果见表2。
3 讨论
对广西14个产地的16份何首乌药材样品中蒽醌的含量测定结果表明，不同产地的何首乌中大黄素及大黄素甲醚含量差异较大，分别为总大黄素在0.00～2.39 mg/g，总大黄素甲醚在0.00～1.34 mg/g。大黄素甲醚的含量在统一何首乌样品中要较大黄素的含量低。另外，通过本次试验研究，分析出大黄素、大黄素甲醚及二苯乙烯苷在广西产的何首乌中的含量与其二苯乙烯苷的含量成正比关系，即样品的蒽醌类化合物含量高，其二苯乙烯苷的含量也高，这一结果也符合前期实验结果，其中，蒽醌类化合物和二苯乙烯苷两者是否具有相伴生，这一问题值得进一步深入研究。此外，不论从药材性状[1]、主要化学成分（蒽醌类成分、二苯乙烯苷）来看，广西平乐县、恭城县、桂林市、宾阳县等地所产何首乌药材质量较符合药典入药要求，而桂西地区一些县市所产何首乌生药性状及成分含量相对于药典则有一定的差距。
本研究结果显示，在相同的采收季节、以相同的方法加工处理的何首乌Polygonum multiflorum块根，广西不同产地其性状、主要化学成分含量存在较大差异，这可能与各地气候、土壤等环境条件有关。有必要对何首乌生长环境及有效成分进行系统研究，总结出广西何首乌的最佳生长条件，为何首乌的规范化栽培提供科学依据。
此外，要加快应用现代科学技术手段开展对何首乌植物功能成分及其药效学研究与开发的步伐，更多的研究要集中在何首乌使用的基础上，运用现代科技手段对其植物的功能成分进行检测分析，开展药效学研究，并广泛应用于中医临床和相关产品开发。
[参考文献]
[1] 肖培根.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2001：518.
[2] 黄权芳，朱华，周燕华，等.两种广西产何首乌的形态组织鉴定[J].时珍国医国药，2010，21（6）：1466-1467.
[3] 严寒静，傅军，梁从庆，等.不同采集地何首乌中蒽醌类成分的含量测定[J].中成药，2007，29（7）：1023-1026.
[4] 朱华，黄权芳，周燕华，等.HPLC法测定广西不同产地何首乌中二苯乙烯苷的含量[J].广西中医药，2006，29（6）：52-54.
[5] 刘燕，晁若冰.HPLC同时测定不同何首乌中的两种蒽醌类成分[J].华西药学杂志，2009，24（3）：285-287.
[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2005-5-14.
（收稿日期：2011-09-22）