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摘要[目的] 为优化淡紫拟青霉几丁质酶的提取工艺。[方法] 以硫酸铵溶液为提取剂，先通过单因素试验，确定硫酸铵浓度、透析温度、透析时间和透析液酸碱度的最佳水平，然后通过正交试验确定最佳浸提条件。[结果]淡紫拟青霉几丁质酶的最佳提取工艺为：硫酸铵浓度60%、透析温度30 ℃、透析时间2 d，透析液pH 6，在该条件下几丁质酶酶活可达0.053 4 U。[结论] 该结果可以为几丁质酶的进一步开发和工业化生产提供一定科学依据。
关键词 淡紫拟青霉；几丁质酶；提取工艺
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10456-03
基金项目浙江省大学生科技创新项目（2011R429010）。
作者简介金亚琳（1993-），女，浙江临海人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，副教授，硕士，从事生物资源开发利用方面的研究。
几丁质（Chitin） 大量存在于昆虫的外骨骼和中肠围食膜（peritrophicm embrane，PM ） 中， 也是大多数真菌细胞壁的主要成分[ 1]，已成为真菌病害和农林害虫有效防治的限制因素之一。几丁质专一性降解酶是几丁质酶。该酶能通过水解几丁质，消解寄主真菌细胞壁，杀死寄主真菌[2-3]，降解昆虫体壁[4]，扰乱昆虫和真菌的正常代谢，达到抑制病虫害的目的。近年来，鉴于几丁质酶在防治病虫害方面的巨大利用潜力， 其研究越来越受到重视。
几丁质酶分布广泛，从微生物到动植物体内都有几丁质酶的存在，尤以微生物种类最多。微生物可用于发酵生产，因此对微生物几丁质酶的研究与开发极具有前景。淡紫拟青霉[Paecilomyces lilacinus（Thom.）Samson]属半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属[5]。该菌广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点，能产生丰富的几丁质酶。近年来对淡紫拟青霉产几丁质酶发酵条件及其酶学特性进行了大量的研究[6-11]，而对于其提取工艺研究较少。因此，笔者以淡紫拟青霉为材料，先通过液体发酵获得发酵液，在单因素试验的基础上，通过正交试验确定影响几丁质酶提取的因素及最适提取条件，为几丁质酶的进一步开发和工业化生产提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1 菌种。 供试菌种为淡紫拟青霉FZ0289，由中国微生物菌种网提供。
1.1.2 培养基。 种子培养基组成为：几丁质0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，MgSO4 0.05%，氯化钠0.5%，K2HPO4 0.03%，pH自然。
产酶培养基组成为：1.5%麦芽浸汁为碳源，2%蛋白胨为氮源，3% 100目几丁质粉，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，pH 6。
1.2透析袋使用前的处理[12] 把透析袋剪成适当长度（10～20 cm）的小段，在大体积的2%（W/V）碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中将透析袋煮沸10 min，用蒸馏水彻底清洗后放在 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中再煮沸10 min，冷却后存放于4 ℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起，取用透析袋时必须戴手套。 用前在透析袋内装满水，然后排出，将之清洗干净。
1.3几丁质酶活性的测定 采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法[13]，测定还原糖含量，其标准曲线的回归方程为y=0.840 5x+0.009 9，式中x为N-乙酰葡萄糖质量（mg），y为吸光值，R2=0.996 2。
在3根1.5 ml离心管中分别加入0.5 ml待测液和0.5 ml浓度1%胶体几丁质；向其中1根离心管加入0.5 ml DNS，放入100 ℃水浴10 min，作为对照；另外3根离心管于40 ℃水浴60 min后，加入0.5 ml DNS，放入100 ℃水浴10 min。 3根管中均加入5 ml蒸馏水，4 000 r/min离心10 min后，取上清液，于540 nm测量OD，根据N乙酰氨基葡萄糖的标准曲线计算出还原糖含量。酶活力单位（U/ml）表示在上述反应条件下，每分钟产生1 μmol还原糖所需酶量。
1.4几丁质酶的发酵 将活化好的菌种接种到种子培养液中，每瓶100 ml，于28 ℃、180 r/min摇床培养3～4 d后，按10%接种量接种到160 ml/500 ml的产酶培养基中，于28 ℃、180 r/min摇床培养4 d。
1.5几丁质酶提取工艺的单因素试验
1.5.1硫酸铵溶液浓度的选择。 将发酵液经 6 000 r/min离心15 min，各取50 ml上清液依次加入质量分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸铵溶液，充分搅拌后静置5 min，离心取沉淀，然后用 pH 6磷酸缓冲液溶解后透析2 d，在540 nm波长下测定几丁质酶活性。
1.5.2透析温度的选择。 将发酵液经6 000 r/min离心15 min，去除沉淀，取上清液，加浓度60%硫酸铵溶液，充分搅拌后静置5 min，离心取沉淀，用磷酸缓冲液溶解后分别于25、30、35、40、45 ℃下透析2 d，在540 nm波长下测定几丁质酶活性。
1.5.3 透析液pH的选择。 将发酵液经6 000 r/min离心15 min，去除沉淀，取上清液，加浓度60%硫酸铵溶液，充分搅拌后静置5 min，离心，取沉淀，用磷酸缓冲液溶解后于不同pH透析液中透析，测定酶活。透析液的pH分别为3、4、5、6、7、8。
1.5.4 透析时间的选择。 将发酵液经6 000 r/min离心15 min，去除沉淀，取上清液，加浓度60%硫酸铵溶液，充分搅拌后，静置5 min，离心，取沉淀，将其溶解后进行不同时间的透析，设置7个相同的透析试验组，以7 d为期限，每天取一组透析后酶溶液测定酶活。 1.6几丁质酶提取工艺条件的正交试验优化 在单因素研究的基础上，以硫酸铵溶液浓度、透析时间、透析温度、透析pH为考察因素，以几丁质酶活性为指标，设置四因素三水平的正交试验，优化几丁质酶提取工艺的最佳参数。
2 结果与分析
2.1几丁质酶提取工艺的单因素试验
2.1.1 最佳硫酸铵浓度的确定。在透析温度30 ℃，透析时间2 d，透析液pH 7的条件下，研究硫酸铵浓度对几丁质酶提取率的影响。由图1可知，在20%～60%硫酸铵浓度范围，几丁质酶活性逐渐增大，在60%浓度下酶活最大，达到0.024 U/ml。随后，硫酸铵溶液浓度继续增加，几丁质酶活性下降。由此可知，过低的硫酸铵浓度可能让几丁质酶不完全沉淀，导致几丁质酶密度低，催化效率低下。较高浓度下硫酸铵溶液能较好地保持淡紫拟青霉的几丁质酶活性。但是，过高的硫酸铵浓度可能会破坏几丁质酶的生物活性，使其丧失应有的催化几丁质功能。因此，综合考虑到几丁质酶提取率和生物学功能的保持，淡紫拟青霉的几丁质酶最佳硫酸铵溶液浸提浓度为60%。
图1硫酸铵浓度对几丁质酶提取率的影响2.1.2 最佳透析温度的确定。由图2可知，在25～30 ℃，随着温度的升高，几丁质酶活性不断增加，在透析温度为30 ℃时几丁质酶活性最大，酶活值达0.018 U/ml。当温度继续升高后，几丁质酶活性不断下降。这可能是由于温度过高破坏了几丁质酶的结构，丧失了催化几丁质的功能，低温不利于几丁质酶催化功能的有效发挥[12]。因此，淡紫拟青霉的几丁质酶的最佳透析温度为30 ℃。
2.1.3 最佳透析液pH的确定。由图3可知，在3～6的pH范围内，几丁质酶活性随着pH的上升而增强，在pH为6时，活性最大，酶活达0.022 U/ml。之后，随着pH的增大，酶活却不断下降。pH对酶活性的影响机制很复杂，pH过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活[14]。因此，综合考虑几丁质酶提取率和生物学功能的保持，淡紫拟青霉的几丁质酶最佳透析pH为6。
2.1.4 最佳透析时间的确定。由图4可知，透析前2 d，几丁质酶活性迅速上升，并在第2天酶活达到最大值（0.019 U/ml）。之后，随着时间的增加，几丁质酶活性逐渐下降。由此可知，时间太短，几丁质酶透析得不充分，自然活性达不到最大值，透析时间过长，硫酸铵溶液和几丁质酶长时间接触，可能减小几丁质酶活性部位的柔性，图4透析时间对几丁质酶提取率的影响使得酶的活力降低。因此，几丁质酶的最佳透析时间为2 d。
2.2几丁质酶提取条件的正交试验优化 在单因素研究的基础上，以硫酸铵溶液浓度（A）、透析时间（B）、透析温度（C）、透析液pH（D）为考察因素，以几丁质酶活性为指标，设计四因素三水平的正交试验，优化几丁质酶提取工艺的最佳参数，其因素水平见表1，试验结果见表2。
由表3可知，4个因素的P值均小于0.01，表明透析温度、硫酸铵浓度、pH、时间对几丁质酶活性的影响差异在0.01水平显著，因此在提取几丁质酶时要控制各因素。由表2的R值可知，4个因素对几丁质酶浸提的影响顺序大小为C>A>D>B，即透析温度对几丁质酶提取的影响最大。由K值可知，四因素三水平最佳提取组合为A3B1C2D2，即几丁质酶
3结论与讨论
通过正交试验，研究了影响淡紫拟青霉几丁质酶提取的因素。研究表明，淡紫拟青霉几丁质酶最佳提取工艺条件为硫酸铵浓度60%，透析时间2 d，透析温度30 ℃，透析pH 6。其中，各因素对几丁质酶浸提的效果大小顺序为透析温度>硫酸铵浓度> 透析pH >透析时间。温度过高或过低都会影响酶的活性。温度低，酶的高效性得不到充分的发挥；温度高，酶的生物结构易发生变化，甚至完全变异失活。这个过程是不可逆的。作为几丁质酶的浸提试剂，把酶以沉淀的方式从混合液中浸提出来，浓度的高低会影响沉淀是否彻底。低浓度的硫酸铵溶液易造成不完全沉淀，使单位体积的几丁质酶量偏少；高浓度的硫酸铵溶液易带来其他蛋白质杂质。徐春花[15]研究绿粘帚霉菌产几丁质酶的条件时发现，当用60%～90%饱和度的硫酸铵分离几丁质酶粗提液时，几丁质酶活性趋于稳定，其中60%饱和度的硫酸铵效果最好且经济。该研究正交条件优化试验得出的最佳硫酸铵饱和度也为60%。
参考文献
[1] 夏文水，吴炎楠.甲壳素/壳聚糖水解酶的研究进展[J].中国海洋药物，1997（2）：31-35.
[2] 郭玉莲.微生物几丁质酶及其在植物病害防治中的作用[J].中国农学通报，2005，21（1）：283-285.
[3] SCHICKLER H，CHT I.Heterologous chitinase gene expression to improve plant defense against phytopathogenic fungi[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，1997，19：196-201.
[4] 张福丽，王志英，王占斌，等.昆虫几丁质酶及其在植物害虫防治中的应用前景[J].中国森林病虫，2007（4）：22.
[5] 赵培静，任文彬，缪承杜，等.淡紫拟青霉研究进展与展望[J].安徽农业科学，2007，35（30）：9672-9674，9793.
[6] 张雯，倪莉，程丽云，等.淡紫拟青霉FZ-0289产几丁质酶的条件优化[J].福建农林大学学报：自然科学版，2005，34（2）：195-199.
[7] 夏秋瑜.几丁质酶高产菌株的筛选及酶法制备几丁寡糖的研究[D].儋州：华南热带农业大学，2006：39-46.
[8] 张雯.淡紫拟青霉产几丁质酶条件和几丁质酶生化特性研究[D].福州：福州大学，2005：30-33.
[9] 高倩，裴玲燕，刘青娥.淡紫拟青霉产几丁质酶发酵条件的优化[J].安徽农业科学，2013（21）：8888-8890.
关键词 淡紫拟青霉；几丁质酶；提取工艺
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10456-03
基金项目浙江省大学生科技创新项目（2011R429010）。
作者简介金亚琳（1993-），女，浙江临海人，本科生，专业：生物科学。*通讯作者，副教授，硕士，从事生物资源开发利用方面的研究。
几丁质（Chitin） 大量存在于昆虫的外骨骼和中肠围食膜（peritrophicm embrane，PM ） 中， 也是大多数真菌细胞壁的主要成分[ 1]，已成为真菌病害和农林害虫有效防治的限制因素之一。几丁质专一性降解酶是几丁质酶。该酶能通过水解几丁质，消解寄主真菌细胞壁，杀死寄主真菌[2-3]，降解昆虫体壁[4]，扰乱昆虫和真菌的正常代谢，达到抑制病虫害的目的。近年来，鉴于几丁质酶在防治病虫害方面的巨大利用潜力， 其研究越来越受到重视。
几丁质酶分布广泛，从微生物到动植物体内都有几丁质酶的存在，尤以微生物种类最多。微生物可用于发酵生产，因此对微生物几丁质酶的研究与开发极具有前景。淡紫拟青霉[Paecilomyces lilacinus（Thom.）Samson]属半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属[5]。该菌广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点，能产生丰富的几丁质酶。近年来对淡紫拟青霉产几丁质酶发酵条件及其酶学特性进行了大量的研究[6-11]，而对于其提取工艺研究较少。因此，笔者以淡紫拟青霉为材料，先通过液体发酵获得发酵液，在单因素试验的基础上，通过正交试验确定影响几丁质酶提取的因素及最适提取条件，为几丁质酶的进一步开发和工业化生产提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1 菌种。 供试菌种为淡紫拟青霉FZ0289，由中国微生物菌种网提供。
1.1.2 培养基。 种子培养基组成为：几丁质0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.1%，MgSO4 0.05%，氯化钠0.5%，K2HPO4 0.03%，pH自然。
产酶培养基组成为：1.5%麦芽浸汁为碳源，2%蛋白胨为氮源，3% 100目几丁质粉，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，pH 6。
1.2透析袋使用前的处理[12] 把透析袋剪成适当长度（10～20 cm）的小段，在大体积的2%（W/V）碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中将透析袋煮沸10 min，用蒸馏水彻底清洗后放在 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中再煮沸10 min，冷却后存放于4 ℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起，取用透析袋时必须戴手套。 用前在透析袋内装满水，然后排出，将之清洗干净。
1.3几丁质酶活性的测定 采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法[13]，测定还原糖含量，其标准曲线的回归方程为y=0.840 5x+0.009 9，式中x为N-乙酰葡萄糖质量（mg），y为吸光值，R2=0.996 2。
在3根1.5 ml离心管中分别加入0.5 ml待测液和0.5 ml浓度1%胶体几丁质；向其中1根离心管加入0.5 ml DNS，放入100 ℃水浴10 min，作为对照；另外3根离心管于40 ℃水浴60 min后，加入0.5 ml DNS，放入100 ℃水浴10 min。 3根管中均加入5 ml蒸馏水，4 000 r/min离心10 min后，取上清液，于540 nm测量OD，根据N乙酰氨基葡萄糖的标准曲线计算出还原糖含量。酶活力单位（U/ml）表示在上述反应条件下，每分钟产生1 μmol还原糖所需酶量。
1.4几丁质酶的发酵 将活化好的菌种接种到种子培养液中，每瓶100 ml，于28 ℃、180 r/min摇床培养3～4 d后，按10%接种量接种到160 ml/500 ml的产酶培养基中，于28 ℃、180 r/min摇床培养4 d。
1.5几丁质酶提取工艺的单因素试验
1.5.1硫酸铵溶液浓度的选择。 将发酵液经 6 000 r/min离心15 min，各取50 ml上清液依次加入质量分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的硫酸铵溶液，充分搅拌后静置5 min，离心取沉淀，然后用 pH 6磷酸缓冲液溶解后透析2 d，在540 nm波长下测定几丁质酶活性。
1.5.2透析温度的选择。 将发酵液经6 000 r/min离心15 min，去除沉淀，取上清液，加浓度60%硫酸铵溶液，充分搅拌后静置5 min，离心取沉淀，用磷酸缓冲液溶解后分别于25、30、35、40、45 ℃下透析2 d，在540 nm波长下测定几丁质酶活性。
1.5.3 透析液pH的选择。 将发酵液经6 000 r/min离心15 min，去除沉淀，取上清液，加浓度60%硫酸铵溶液，充分搅拌后静置5 min，离心，取沉淀，用磷酸缓冲液溶解后于不同pH透析液中透析，测定酶活。透析液的pH分别为3、4、5、6、7、8。
1.5.4 透析时间的选择。 将发酵液经6 000 r/min离心15 min，去除沉淀，取上清液，加浓度60%硫酸铵溶液，充分搅拌后，静置5 min，离心，取沉淀，将其溶解后进行不同时间的透析，设置7个相同的透析试验组，以7 d为期限，每天取一组透析后酶溶液测定酶活。 1.6几丁质酶提取工艺条件的正交试验优化 在单因素研究的基础上，以硫酸铵溶液浓度、透析时间、透析温度、透析pH为考察因素，以几丁质酶活性为指标，设置四因素三水平的正交试验，优化几丁质酶提取工艺的最佳参数。
2 结果与分析
2.1几丁质酶提取工艺的单因素试验
2.1.1 最佳硫酸铵浓度的确定。在透析温度30 ℃，透析时间2 d，透析液pH 7的条件下，研究硫酸铵浓度对几丁质酶提取率的影响。由图1可知，在20%～60%硫酸铵浓度范围，几丁质酶活性逐渐增大，在60%浓度下酶活最大，达到0.024 U/ml。随后，硫酸铵溶液浓度继续增加，几丁质酶活性下降。由此可知，过低的硫酸铵浓度可能让几丁质酶不完全沉淀，导致几丁质酶密度低，催化效率低下。较高浓度下硫酸铵溶液能较好地保持淡紫拟青霉的几丁质酶活性。但是，过高的硫酸铵浓度可能会破坏几丁质酶的生物活性，使其丧失应有的催化几丁质功能。因此，综合考虑到几丁质酶提取率和生物学功能的保持，淡紫拟青霉的几丁质酶最佳硫酸铵溶液浸提浓度为60%。
图1硫酸铵浓度对几丁质酶提取率的影响2.1.2 最佳透析温度的确定。由图2可知，在25～30 ℃，随着温度的升高，几丁质酶活性不断增加，在透析温度为30 ℃时几丁质酶活性最大，酶活值达0.018 U/ml。当温度继续升高后，几丁质酶活性不断下降。这可能是由于温度过高破坏了几丁质酶的结构，丧失了催化几丁质的功能，低温不利于几丁质酶催化功能的有效发挥[12]。因此，淡紫拟青霉的几丁质酶的最佳透析温度为30 ℃。
2.1.3 最佳透析液pH的确定。由图3可知，在3～6的pH范围内，几丁质酶活性随着pH的上升而增强，在pH为6时，活性最大，酶活达0.022 U/ml。之后，随着pH的增大，酶活却不断下降。pH对酶活性的影响机制很复杂，pH过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活[14]。因此，综合考虑几丁质酶提取率和生物学功能的保持，淡紫拟青霉的几丁质酶最佳透析pH为6。
2.1.4 最佳透析时间的确定。由图4可知，透析前2 d，几丁质酶活性迅速上升，并在第2天酶活达到最大值（0.019 U/ml）。之后，随着时间的增加，几丁质酶活性逐渐下降。由此可知，时间太短，几丁质酶透析得不充分，自然活性达不到最大值，透析时间过长，硫酸铵溶液和几丁质酶长时间接触，可能减小几丁质酶活性部位的柔性，图4透析时间对几丁质酶提取率的影响使得酶的活力降低。因此，几丁质酶的最佳透析时间为2 d。
2.2几丁质酶提取条件的正交试验优化 在单因素研究的基础上，以硫酸铵溶液浓度（A）、透析时间（B）、透析温度（C）、透析液pH（D）为考察因素，以几丁质酶活性为指标，设计四因素三水平的正交试验，优化几丁质酶提取工艺的最佳参数，其因素水平见表1，试验结果见表2。
由表3可知，4个因素的P值均小于0.01，表明透析温度、硫酸铵浓度、pH、时间对几丁质酶活性的影响差异在0.01水平显著，因此在提取几丁质酶时要控制各因素。由表2的R值可知，4个因素对几丁质酶浸提的影响顺序大小为C>A>D>B，即透析温度对几丁质酶提取的影响最大。由K值可知，四因素三水平最佳提取组合为A3B1C2D2，即几丁质酶
3结论与讨论
通过正交试验，研究了影响淡紫拟青霉几丁质酶提取的因素。研究表明，淡紫拟青霉几丁质酶最佳提取工艺条件为硫酸铵浓度60%，透析时间2 d，透析温度30 ℃，透析pH 6。其中，各因素对几丁质酶浸提的效果大小顺序为透析温度>硫酸铵浓度> 透析pH >透析时间。温度过高或过低都会影响酶的活性。温度低，酶的高效性得不到充分的发挥；温度高，酶的生物结构易发生变化，甚至完全变异失活。这个过程是不可逆的。作为几丁质酶的浸提试剂，把酶以沉淀的方式从混合液中浸提出来，浓度的高低会影响沉淀是否彻底。低浓度的硫酸铵溶液易造成不完全沉淀，使单位体积的几丁质酶量偏少；高浓度的硫酸铵溶液易带来其他蛋白质杂质。徐春花[15]研究绿粘帚霉菌产几丁质酶的条件时发现，当用60%～90%饱和度的硫酸铵分离几丁质酶粗提液时，几丁质酶活性趋于稳定，其中60%饱和度的硫酸铵效果最好且经济。该研究正交条件优化试验得出的最佳硫酸铵饱和度也为60%。
参考文献
[1] 夏文水，吴炎楠.甲壳素/壳聚糖水解酶的研究进展[J].中国海洋药物，1997（2）：31-35.
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[6] 张雯，倪莉，程丽云，等.淡紫拟青霉FZ-0289产几丁质酶的条件优化[J].福建农林大学学报：自然科学版，2005，34（2）：195-199.
[7] 夏秋瑜.几丁质酶高产菌株的筛选及酶法制备几丁寡糖的研究[D].儋州：华南热带农业大学，2006：39-46.
[8] 张雯.淡紫拟青霉产几丁质酶条件和几丁质酶生化特性研究[D].福州：福州大学，2005：30-33.
[9] 高倩，裴玲燕，刘青娥.淡紫拟青霉产几丁质酶发酵条件的优化[J].安徽农业科学，2013（21）：8888-8890.