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摘要：以菊科植物水飞蓟为试验材料，研究不同浓度赤霉素和矮壮素溶液对水飞蓟宾含量和一些生理特征的影响。结果表明，在100～300 mg/L赤霉素处理下，水飞蓟宾的含量先下降后上升，但低于对照；丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、叶绿素含量、水飞蓟产量和株高均在200 mg/L时达到最高值。在100～300 mg/L矮壮素处理下，水飞蓟宾的含量、丙二醛含量、SOD、CAT、叶绿素含量均随着浓度增加而增大，而POD、水飞蓟产量和株高变化不大。
关键词：水飞蓟；水飞蓟宾；赤霉素；矮壮素
中图分类号： S567.204文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0334-03
收稿日期：2011-11-07
基金项目：吉林农业科技学院重点学科培育项目。
作者简介：刘广娜（1982—），女，吉林临江人，硕士，讲师，研究方向生物技术在中草药中的应用。E-mail：95471067@qq.com。
通信作者：赵权，博士，教授，研究方向中草药遗传机理研究。E-mail：zhaoquanbs@163.com。水飞蓟（Silybum marianum Gaertn.） 为菊科水飞蓟属草本植物，是治疗肝炎的民间用药。20 世纪 60 年代末，德国药学家Wanger 等首次从水飞蓟果实中提取出了药用活性成分，并将其命名为 sily-marin[1]。此后，国内外医药研究者对水飞蓟的栽培育种[2]、化学成分[3]、提取工艺[4]及药理药效[5]等各方面均进行了较深入的研究。目前研究发现，水飞蓟素除具有预防和治疗肝胆疾病外，还具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、提高免疫力等多种功能[6]。赤霉素是调节植物生长发育的五大激素之一，与植物的生长和发育有着密切关系。目前使用最广泛、研究最多的是赤霉素类的赤霉素酸（GA3），其主要功能是刺激茎顶端细胞分裂、刺激茎伸长和促进RNA和蛋白质的合成。矮壮素（CCC）是一种植物生长调节剂，它能够控制植株的营养生长，促进生殖生长，使植株的节间缩短、矮壮并抗倒伏，促进叶片颜色加深，光合作用加强，提高植株坐果率、抗旱性、抗寒性和抗盐碱能力。本试验主要研究不同浓度赤霉素和矮壮素对水飞蓟宾含量和一些生理特征的影响，选出适宜浓度的植物生长调节剂，探索水飞蓟栽培新技术，为提高水飞蓟相关品质提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
水飞蓟种子由吉林农业科技学院中药学院实验基地提供。
1.2田间试验
田间试验采用大田栽培法。于5月中旬播种，7月中旬挑选生长状况良好并一致的水飞蓟进行赤霉素和矮壮素处理，设定浓度为100、200、300 mg/L，单株喷施量为30 mL，对照（CK）喷施等量自来水，每组处理3次重复。10 d喷1次，连续喷药3次。第1次喷药当天测量株高，以后每隔10 d测量1次，做好相应记录。
1.3测定项目与方法
1.3.1水飞蓟宾含量的测定取HPLC测定用对照品溶液各1、2、3、4、5、6 μL，按预定色谱条件进样分析，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到水飞蓟宾A、B的标准曲线（图1、图2）。
标准品溶液制备：精确称取水飞蓟素标准品5.0 mg，于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为HPLC法测定用各标准品溶液。
供试溶液制备：精确称量水飞蓟新鲜种子5 g，经烘箱干燥至种子水分完全散发。再将烘干的种子粉碎，精确称量1 g，用50 mL石油醚在70 ℃下回流3 h。待提取完成后，将溶液过滤，残渣用滤纸包裹并温风吹干。精确加入150 mL乙酸乙酯，78 ℃水浴回流3 h，过滤提取液并用20 mL乙酸乙酯分2次洗涤烧瓶以及滤纸。合并滤液和洗涤液浓缩至干，以1 mL色谱纯甲醇定容，即为HPLC测定用水飞蓟素供试溶液。
1.3.2丙二醛含量的测定根据张治安等的方法[7]测定丙二醛含量：MDA含量=（CVTV1）/（1 000V2m）。式中，C为MDA浓度（μmol/L）；VT为样品提取液的总体积，mL；V1为样品提取液和TBA溶液总反应液体积，mL；V2为于TBA反应的样品提取液体积，mL；m为鲜样品质量，g；1 000是将mL换算成L的系数。
1.3.3超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定根据张治安等的方法[7]测定SOD活性：取低温保存的鲜样，称2 g左右的叶片放在50 mL的离心管，加入20 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值=7.8），研磨，8 000 r/min冷冻离心20 min，上清液为粗酶液。测试时取3 mL反应液 0.02 mL叶的粗酶液，于光照培养箱中培养6～10 min，650 nm下测定吸光度。
1.3.4过氧化物酶（POD）活性的测定根据张治安等的方法[7]测定POD活性：2 mL 0.3%H2O2溶液 0.95 mL 0.2%愈创木酚溶液 1 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS，pH值=7.0） 0.02 mL酶液（对照用0.05 mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液），记录470 nm处吸光度降低速度。
1.3.5过氧化氢酶（CAT）活性的测定根据张治安等的方法[7]测定CAT活性：1 mL 0.3%H2O2溶液 1.9 mLH2O 0.1 mL 酶液，测定240 nm处吸光度降低速度。
1.3.6叶绿素含量的测定用TYS-A叶绿素测定仪直接测定叶绿素含量。
1.3.7水飞蓟产量的测定成熟期，各个小区单独收取水飞蓟种子，分别测定每个小区的水飞蓟产量。
1.3.8水飞蓟株高的测定对水飞蓟使用植物生长调节剂后，每隔10 d对每个小区其中3株水飞蓟测量株高，并取平均值。 2结果与分析
2.1赤霉素和矮壮素对水飞蓟宾含量的影响
由图3和图4可知，本试验成功提取出了水飞蓟宾。由图5可知，赤霉素和矮壮素处理过的水飞蓟中水飞蓟宾含量均低于对照，但在试验所选择的处理浓度（100～300 mg/L）中，随着矮壮素浓度的增加，水飞蓟宾含量逐渐升高。
2.2赤霉素和矮壮素对丙二醛含量的影响
由图6可见，MDA含量呈先大幅升高，后趋于平缓的趋势，且矮壮素在100～300 mg/L之间，MDA含量随浓度增加而增加。
2.3赤霉素和矮壮素对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
由图7可见，赤霉素对SOD活性的影响是先促进后抑制的。而矮壮素对SOD活性影响在试验浓度内是一直上升的。
2.4赤霉素和矮壮素对过氧化物酶（POD）活性的影响
由图8可见，随着赤霉素浓度的增加，过氧化物酶活性先逐渐升高后下降，200 mg/L时达到极值，说明，体内代谢能力对赤霉素浓度的增加有一个逐渐适应的过程。而POD活性随矮壮素浓度变化波动幅度较小，无显著变化。
2.5赤霉素和矮壮素对过氧化氢酶（CAT）的活性影响
由图9可见，随着赤霉素浓度的升高，CAT的活性先升高后下降，说明随着赤霉素浓度增加，CAT的活性也随着增加，但随后可能植物体内产生某种抑制酶活性的物质，导致酶活性降低；但CAT的活性随着矮壮素浓度的增加而增加。
2.6赤霉素和矮壮素对水飞蓟叶绿素含量的影响
由图10可以看出，赤霉素处理后的水飞蓟叶绿素含量呈现先升高后降低的趋势，说明随着赤霉素浓度的增加，植物体
内抵抗能力有一个逐渐适应和产生的过程。矮壮素处理的水飞蓟在试验浓度内是处于上升状态的，叶绿素合成持续增加。
2.7水飞蓟产量的测定结果
由图11可见，赤霉素处理的水飞蓟产量稍有增加，并且在200 mg/L时产量最高；而矮壮素处理的水飞蓟产量稍有减少，但总体减少并不明显。故用200 mg/L的赤霉素处理水飞蓟较适宜。
2.8赤霉素和矮壮素对水飞蓟株高的影响
由图12可以看出，赤霉素会促进植物生长，使其株高在短时间变高；矮壮素不会使植物从高变矮，而是使其生长减缓，低于正常水平。
3讨论
在本试验所采用的矮壮素的2种浓度条件下，水飞蓟宾的含量持续增加，但均低于对照；丙二醛含量、SOD活性、CAT活性、叶绿素含量均持续升高；对POD活性影响不大。所采用的赤霉素浓度处理水飞蓟，得到的水飞蓟产量和空白对照比稍有增加，浓度200 mg/L的时候产量最高。本试验为药用植物引种驯化、中药鉴定以及合理利用土地资源提供了理论
依据。但是植物生长调节剂对药用植物初级代谢产物和次级代谢产物的影响作用机制以及作用程度尚须深入研究。
参考文献：
[1]张淑丽，杨世海，张海弢，等. 水飞蓟有效成分及其提取方法研究进展[J]. 人参研究，2012（4）：51-54.
[2]马尧，庄云，姚运生，等. 不同播种期对水飞蓟植株生长的影响[J]. 江苏农业科学，2008（2）：155-158.
[3]王敏，张宇，张宏莲，等. 水飞蓟茎叶化学成分研究[J]. 黑龙江医药科学，2010，33（1）：78-79.
[4]史劲松，孙达峰，顾龚平，等. 水飞蓟素提取工艺的改进和探讨[J]. 中国野生植物资源，2006，25（6）：52-54.
[5]陈洪轩，周晓丹，陈志鹏. 水飞蓟宾乳脂体注射剂在大鼠体内的药代动力学[J]. 中成药，2011，33（6）：965-968.
[6]王红军，姜媛媛，路平，等. 水飞蓟宾的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节分子药理学机制研究进展[J]. 药学学报，2010，45（4）：413-421.
[7]张治安，陈展宇. 植物生理学实验技术[M]. 长春：吉林大学出版社，2008：102-208.张丽，薛妍君，邓金花，等. 真空干燥对野生荠菜品质的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：337-339.
关键词：水飞蓟；水飞蓟宾；赤霉素；矮壮素
中图分类号： S567.204文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0334-03
收稿日期：2011-11-07
基金项目：吉林农业科技学院重点学科培育项目。
作者简介：刘广娜（1982—），女，吉林临江人，硕士，讲师，研究方向生物技术在中草药中的应用。E-mail：95471067@qq.com。
通信作者：赵权，博士，教授，研究方向中草药遗传机理研究。E-mail：zhaoquanbs@163.com。水飞蓟（Silybum marianum Gaertn.） 为菊科水飞蓟属草本植物，是治疗肝炎的民间用药。20 世纪 60 年代末，德国药学家Wanger 等首次从水飞蓟果实中提取出了药用活性成分，并将其命名为 sily-marin[1]。此后，国内外医药研究者对水飞蓟的栽培育种[2]、化学成分[3]、提取工艺[4]及药理药效[5]等各方面均进行了较深入的研究。目前研究发现，水飞蓟素除具有预防和治疗肝胆疾病外，还具有抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、提高免疫力等多种功能[6]。赤霉素是调节植物生长发育的五大激素之一，与植物的生长和发育有着密切关系。目前使用最广泛、研究最多的是赤霉素类的赤霉素酸（GA3），其主要功能是刺激茎顶端细胞分裂、刺激茎伸长和促进RNA和蛋白质的合成。矮壮素（CCC）是一种植物生长调节剂，它能够控制植株的营养生长，促进生殖生长，使植株的节间缩短、矮壮并抗倒伏，促进叶片颜色加深，光合作用加强，提高植株坐果率、抗旱性、抗寒性和抗盐碱能力。本试验主要研究不同浓度赤霉素和矮壮素对水飞蓟宾含量和一些生理特征的影响，选出适宜浓度的植物生长调节剂，探索水飞蓟栽培新技术，为提高水飞蓟相关品质提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
水飞蓟种子由吉林农业科技学院中药学院实验基地提供。
1.2田间试验
田间试验采用大田栽培法。于5月中旬播种，7月中旬挑选生长状况良好并一致的水飞蓟进行赤霉素和矮壮素处理，设定浓度为100、200、300 mg/L，单株喷施量为30 mL，对照（CK）喷施等量自来水，每组处理3次重复。10 d喷1次，连续喷药3次。第1次喷药当天测量株高，以后每隔10 d测量1次，做好相应记录。
1.3测定项目与方法
1.3.1水飞蓟宾含量的测定取HPLC测定用对照品溶液各1、2、3、4、5、6 μL，按预定色谱条件进样分析，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，分别得到水飞蓟宾A、B的标准曲线（图1、图2）。
标准品溶液制备：精确称取水飞蓟素标准品5.0 mg，于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为HPLC法测定用各标准品溶液。
供试溶液制备：精确称量水飞蓟新鲜种子5 g，经烘箱干燥至种子水分完全散发。再将烘干的种子粉碎，精确称量1 g，用50 mL石油醚在70 ℃下回流3 h。待提取完成后，将溶液过滤，残渣用滤纸包裹并温风吹干。精确加入150 mL乙酸乙酯，78 ℃水浴回流3 h，过滤提取液并用20 mL乙酸乙酯分2次洗涤烧瓶以及滤纸。合并滤液和洗涤液浓缩至干，以1 mL色谱纯甲醇定容，即为HPLC测定用水飞蓟素供试溶液。
1.3.2丙二醛含量的测定根据张治安等的方法[7]测定丙二醛含量：MDA含量=（CVTV1）/（1 000V2m）。式中，C为MDA浓度（μmol/L）；VT为样品提取液的总体积，mL；V1为样品提取液和TBA溶液总反应液体积，mL；V2为于TBA反应的样品提取液体积，mL；m为鲜样品质量，g；1 000是将mL换算成L的系数。
1.3.3超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定根据张治安等的方法[7]测定SOD活性：取低温保存的鲜样，称2 g左右的叶片放在50 mL的离心管，加入20 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲溶液（pH值=7.8），研磨，8 000 r/min冷冻离心20 min，上清液为粗酶液。测试时取3 mL反应液 0.02 mL叶的粗酶液，于光照培养箱中培养6～10 min，650 nm下测定吸光度。
1.3.4过氧化物酶（POD）活性的测定根据张治安等的方法[7]测定POD活性：2 mL 0.3%H2O2溶液 0.95 mL 0.2%愈创木酚溶液 1 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS，pH值=7.0） 0.02 mL酶液（对照用0.05 mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液），记录470 nm处吸光度降低速度。
1.3.5过氧化氢酶（CAT）活性的测定根据张治安等的方法[7]测定CAT活性：1 mL 0.3%H2O2溶液 1.9 mLH2O 0.1 mL 酶液，测定240 nm处吸光度降低速度。
1.3.6叶绿素含量的测定用TYS-A叶绿素测定仪直接测定叶绿素含量。
1.3.7水飞蓟产量的测定成熟期，各个小区单独收取水飞蓟种子，分别测定每个小区的水飞蓟产量。
1.3.8水飞蓟株高的测定对水飞蓟使用植物生长调节剂后，每隔10 d对每个小区其中3株水飞蓟测量株高，并取平均值。 2结果与分析
2.1赤霉素和矮壮素对水飞蓟宾含量的影响
由图3和图4可知，本试验成功提取出了水飞蓟宾。由图5可知，赤霉素和矮壮素处理过的水飞蓟中水飞蓟宾含量均低于对照，但在试验所选择的处理浓度（100～300 mg/L）中，随着矮壮素浓度的增加，水飞蓟宾含量逐渐升高。
2.2赤霉素和矮壮素对丙二醛含量的影响
由图6可见，MDA含量呈先大幅升高，后趋于平缓的趋势，且矮壮素在100～300 mg/L之间，MDA含量随浓度增加而增加。
2.3赤霉素和矮壮素对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
由图7可见，赤霉素对SOD活性的影响是先促进后抑制的。而矮壮素对SOD活性影响在试验浓度内是一直上升的。
2.4赤霉素和矮壮素对过氧化物酶（POD）活性的影响
由图8可见，随着赤霉素浓度的增加，过氧化物酶活性先逐渐升高后下降，200 mg/L时达到极值，说明，体内代谢能力对赤霉素浓度的增加有一个逐渐适应的过程。而POD活性随矮壮素浓度变化波动幅度较小，无显著变化。
2.5赤霉素和矮壮素对过氧化氢酶（CAT）的活性影响
由图9可见，随着赤霉素浓度的升高，CAT的活性先升高后下降，说明随着赤霉素浓度增加，CAT的活性也随着增加，但随后可能植物体内产生某种抑制酶活性的物质，导致酶活性降低；但CAT的活性随着矮壮素浓度的增加而增加。
2.6赤霉素和矮壮素对水飞蓟叶绿素含量的影响
由图10可以看出，赤霉素处理后的水飞蓟叶绿素含量呈现先升高后降低的趋势，说明随着赤霉素浓度的增加，植物体
内抵抗能力有一个逐渐适应和产生的过程。矮壮素处理的水飞蓟在试验浓度内是处于上升状态的，叶绿素合成持续增加。
2.7水飞蓟产量的测定结果
由图11可见，赤霉素处理的水飞蓟产量稍有增加，并且在200 mg/L时产量最高；而矮壮素处理的水飞蓟产量稍有减少，但总体减少并不明显。故用200 mg/L的赤霉素处理水飞蓟较适宜。
2.8赤霉素和矮壮素对水飞蓟株高的影响
由图12可以看出，赤霉素会促进植物生长，使其株高在短时间变高；矮壮素不会使植物从高变矮，而是使其生长减缓，低于正常水平。
3讨论
在本试验所采用的矮壮素的2种浓度条件下，水飞蓟宾的含量持续增加，但均低于对照；丙二醛含量、SOD活性、CAT活性、叶绿素含量均持续升高；对POD活性影响不大。所采用的赤霉素浓度处理水飞蓟，得到的水飞蓟产量和空白对照比稍有增加，浓度200 mg/L的时候产量最高。本试验为药用植物引种驯化、中药鉴定以及合理利用土地资源提供了理论
依据。但是植物生长调节剂对药用植物初级代谢产物和次级代谢产物的影响作用机制以及作用程度尚须深入研究。
参考文献：
[1]张淑丽，杨世海，张海弢，等. 水飞蓟有效成分及其提取方法研究进展[J]. 人参研究，2012（4）：51-54.
[2]马尧，庄云，姚运生，等. 不同播种期对水飞蓟植株生长的影响[J]. 江苏农业科学，2008（2）：155-158.
[3]王敏，张宇，张宏莲，等. 水飞蓟茎叶化学成分研究[J]. 黑龙江医药科学，2010，33（1）：78-79.
[4]史劲松，孙达峰，顾龚平，等. 水飞蓟素提取工艺的改进和探讨[J]. 中国野生植物资源，2006，25（6）：52-54.
[5]陈洪轩，周晓丹，陈志鹏. 水飞蓟宾乳脂体注射剂在大鼠体内的药代动力学[J]. 中成药，2011，33（6）：965-968.
[6]王红军，姜媛媛，路平，等. 水飞蓟宾的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节分子药理学机制研究进展[J]. 药学学报，2010，45（4）：413-421.
[7]张治安，陈展宇. 植物生理学实验技术[M]. 长春：吉林大学出版社，2008：102-208.张丽，薛妍君，邓金花，等. 真空干燥对野生荠菜品质的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（11：337-339.