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摘要 [目的]提取烟草中的香味成分，并用LC-MS/MS方法对其进行测定和分析。[方法]烟草样品经甲醇溶液超声萃取后，取上清液直接进样LC-MS/MS分析，采用电喷雾正离子多反应监测方式检测，并采用柱后预分离糖基体，消除其对香味成分离子化的影响。[结果]各香味成分线性关系良好（R2≥ 0.982 2），加标回收率为82.43% ～ 95.77%，平均相对标准偏差（RSD）为2.00%～ 4.58%。[结论]该方法灵敏、准确，分析速度快，适合烟草中香味成分检测。
关键词 烟草；香味成分；LC-MS/MS；超声提取
中图分类号 TS424 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0178-04
Abstract [Objective]Aroma components in tobacco were extracted and assayed and analyzed by LCMS/MS method.[Method]After the tobacco sample was extracted by the methanol solution， the supernatant was directly analyzed by LCMS/MS. Electrospray positive ion multiple reaction monitoring was used to detect and use the postcolumn preseparation of the sugar matrix to eliminate its effect on the ionization of aroma components.[Result]The linear relationship of the flavor components was good （R2≥0.982 2）， the spike recovery was 82.43%-95.77%， and the average relative standard deviation （RSD） was 2.00%-4.58%.[Conclusion]The method is sensitive， accurate and analysis speed fast，which is suitable for the detection of aroma components in tobacco.
Key words Tobacco；Aroma components；LCMS/MS；Ultrasound extraction
香味成分对烟叶品质具有决定性作用，是衡量烟叶质量的重要指标[1]。烟草中香味物质种类多、含量少，需要采用合适的前处理方法和灵敏的分析测试手段[2]。常用测定方法是样品经预处理后，GC-MS定性定量分析[3-4]。主要预处理方法有溶剂萃取（SE）[5]和同时蒸馏萃取（SDE）[6]等方法。SE 法是一种常用提取烟草香味物质的方法，但共存基体成分复杂，影响香味成分的准确定量。SDE法集提取、蒸馏和萃取于一身，是目前烟草香味成分测定的常用预处理方法，但由于该方法需高温蒸馏，易引起烟草中糖类和氨基酸发生梅拉德（Maillard）反应，生成香味成分，影响烟草中的糠醛、呋喃类等焦甜香香味成分的测定，使得测定结果与烟草实际含量存在偏差。LC-MS/MS法[7-8]可直接分析样品提取液中香味成分。但样品提取液中含有大量糖基体，影响香味成分的质谱定量。
笔者利用糖基体的色谱保留时间小于香味成分，在柱后分离糖基体，避免其进入质谱仪，消除糖基体对香味成分离子化的影响，旨在建立LC-MS/MS方法定量测定烟草中香味成分。
1 材料與方法
1.1 试材
烤烟（云烟100）；二氯甲烷、甲醇、乙酸铵、乙腈（色谱纯，美国Tedia试剂公司）；一次性针头过滤器（0.22 μm有机系，国药集团化学试剂有限公司）。5种香味物质标样：β-紫罗兰酮、甲基环戊烯醇酮、γ-丁内酯、2-乙酰呋喃、4-羟基-2，5-二甲基呋喃酮（纯度均大于98%，英国Alfa Aesar 公司）。
1.2 仪器
Waters Acquity 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AL204-IC型电子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士 Mettler Toledo 公司）；API 4000 QTRAP质谱仪（美国应用生物系统公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。
1.3 标准溶液的配制
分别准确称取香味物质标样各0.2 g，用甲醇配制成20 μg/mL的标准储备溶液，逐步稀释成不同浓度标准工作溶液。
1.4 样品处理与分析
使用0.3 μg/mL各物质标准溶液对色谱和质谱条件进行优化，方法优化完成后，再对样品前处理过程进行优化（超声辅助温度和时间、萃取溶剂），最后采用基体柱切换技术进样分析。
准确称取1 g烟末于50 mL锥形瓶中，加入20 mL甲醇，在室温下超声萃取30 min，转移至50 mL离心管中，3 000 r/min下离心5 min，取上清液经0.22 μm有机系滤膜过滤后LC-MS/MS分析。
1.5 色谱质谱分析条件
色谱柱：Nova-Pak C18色谱柱（4 μm，3.9 mm×150 mm，美国Waters公司）；流动相：A相为0.1%乙酸铵水溶液，B相为甲醇；流速0.4 mL/min。梯度洗脱条件：0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A。柱温20 ℃，进样量5 μL。 质谱电喷雾正离子模式（ESI+），电喷雾电压4 500 V，离子源温度500 ℃；离子源辅助气1：275.79 kPa，离子源辅助气2：275.79 kPa。
2 结果与分析
2.1 LC-MS/MS方法优化
2.1.1 色谱条件优化。
分别以水或0.1%乙酸铵水溶液为流动相A，以乙腈或甲醇为流动相B，研究在不同洗脱梯度下测定2 μg/mL混合标准样品的分离效果。结果表明，当流动相A为0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇，洗脱条件为0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A时各化合物可完全分离。
2.1.2 质谱条件优化。
采用ESI源自动注射泵进样手动优化多反应监测扫描（MRM）定量方法。连续注射300 ng/mL各种物质标准溶液进行Q1全扫描确定母离子，采用Q2碎片离子扫描确定子离子，然后依次优化去簇电压（DP）和碰撞能量（CE），以提高灵敏度使得信号稳定。最终选定定量离子对和最佳质谱检测条件见表1。
2.2 前处理条件优化
2.2.1 萃取溶剂的选择。
分别研究甲醇、乙醇、乙腈作为提取试剂对香味物质提取效率的影响，结果如图1所示。由图1可知，乙醇提取效率最低，乙腈次之，甲醇提取效率最高，因此选择甲醇作为香味成分的提取试剂。
2.2.2 萃取条件的选择。
以甲醇为提取剂，考察了超声辅助萃取的温度和时间对提取效率的影响。结果表明，萃取温度（20～50 ℃）对提取效果影响不大，且温度过高对香味物质会产生影响。提取效率随着时间延长而增加（图2），当萃取时间到达30 min时，提取效率最高，之后无明显变化。因此，选择萃取温度和时间分别为20 ℃和30 min。
2.3 工作曲线、检测限和定量限
准确配制系列混合标准溶液，按照“2.1”优化后的条件进行定量分析，以各标样成分峰面积（y）对相应的浓度（x，ng/L）进行线性回归分析，得到标准曲线方程、线性范围及决定系数（表2）。由表2可知，各目标化合物相关性良好，适合定量分析。
2.4 样品分析
在上述优化条件下对同一烟草样品平行测定6次，结果见表3。将一定量的混合标样加到烟草样品中，加标样品和未加标样品平行进行前处理和定量分析。由表3可知，加标回收率为82.43%～95.77%，RSD为2.00%～4.58%。
2.5 基质效应
采用甲醇提取烟草中香味物质成分LC-MS/MS定量，具有操作简便、环境友好等优点，但此法一个显著缺点是存在基体干扰，基体中的干扰组分在电喷雾液滴表面离子化过程中与待测组分产生竞争，从而影响了电喷雾的离子化效率，即待测组分离子化效率与进入电喷雾离子源的基体有密切关系。如图3可见，香味物质信号随葡萄糖增加而显著下降。
从葡萄糖和各香味物质选择离子流色谱图（图4）可以看出，葡萄糖保留时间在5 min之前，而各香味成分保留时间在10 min之后，因此可以利用保留时间的不同，对干扰成分和目标成分进行分离处理。
圖5所示的是样品经甲醇超声提取后直接进样分析结果，葡萄糖对待测组分信号产生极大的干扰，γ-丁内酯和4-羟基-2，5-二甲基呋喃酮基线升高，β-紫罗兰酮、2-乙酰呋喃、甲基环戊烯醇酮信号较弱且杂峰较多。该研究根据葡萄糖和香味成分保留时间差值较大，采用基体柱后分离技术，在2 min时使用切换阀把糖分切入废液瓶，向质谱里通入甲醇溶剂，5 min时把切换阀切回至原来位置，使香味成分进入质谱进行测定，这样可消除糖引起的基质效应，结果如图6所示，待测组分信号显著增强。
3 结论
该研究利用糖基体的色谱保留时间小于香味成分，建立了基体柱切换-高效液相色谱串联质谱法直接测定烟草中弱极性香味成分方法。该方法可以有效消除香味成分测定过程中的假阳性问题，消除了基质抑制的现象，并免除了样品衍生化处理过程，具有前处理过程简单、省时和重复性好且灵敏度高等优点，适用于烟草中香味成分的快速、准确测定。
参考文献
[1] 周冀衡，朱小平，王彦亭，等.烟草生理与生物化学[M].合肥：中国科学技术大学出版社，1996.
[2] FUJIMORI T，KASUGA R，MATSUSHITA H，et al.Netural aroma constituents in burley tobacco[J].Agricultural and biological chemistry，1979，40（2）：303-315.
[3] 黄兰，徐迎波，田振峰，等.气相色谱-质谱/选择离子监测法分析烟草中的重要香味物质[J].烟草科技，2012（1）：34-42.
[4] DING Y，ZHU L J，LIU S M，et al.Analytical method of free and conjugated neutral aroma components in tobacco by solvent extraction coupled with comprehensive twodimensional gas chromatographytimeofflight mass spectrometry[J].Journal of chromatography A，2013，1280：122-127.
[5] KIM K R，ZLATKIS A，PARK J W，et al.Isolation of essential oils from tobacco by gas co-distillation/solvent extraction[J].Chromatographia，1982，15（9）：559-563.
[6] 吴鸣，赵明月，赵晓东，等.几种国内外混合型卷烟烟丝中香味物质的分析比较[J].中国烟草学报，2002，8（4）：1-9.
[7] 吴新华，朱瑞芝，任卓英，等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法分离鉴定烟草中5种糖苷类香味前体物质[J].色谱，2009，27（6）：820-824.
[8] ASZYK J，KUBICA P，KOTWASIK A，et al.Comprehensive determination of flavouring additives and nicotine in ecigarette refill solutions.Part I：Liquid chromatographytandem mass spectrometry analysis[J].Journal of chromatography A，2017，1519：45-54.
关键词 烟草；香味成分；LC-MS/MS；超声提取
中图分类号 TS424 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0178-04
Abstract [Objective]Aroma components in tobacco were extracted and assayed and analyzed by LCMS/MS method.[Method]After the tobacco sample was extracted by the methanol solution， the supernatant was directly analyzed by LCMS/MS. Electrospray positive ion multiple reaction monitoring was used to detect and use the postcolumn preseparation of the sugar matrix to eliminate its effect on the ionization of aroma components.[Result]The linear relationship of the flavor components was good （R2≥0.982 2）， the spike recovery was 82.43%-95.77%， and the average relative standard deviation （RSD） was 2.00%-4.58%.[Conclusion]The method is sensitive， accurate and analysis speed fast，which is suitable for the detection of aroma components in tobacco.
Key words Tobacco；Aroma components；LCMS/MS；Ultrasound extraction
香味成分对烟叶品质具有决定性作用，是衡量烟叶质量的重要指标[1]。烟草中香味物质种类多、含量少，需要采用合适的前处理方法和灵敏的分析测试手段[2]。常用测定方法是样品经预处理后，GC-MS定性定量分析[3-4]。主要预处理方法有溶剂萃取（SE）[5]和同时蒸馏萃取（SDE）[6]等方法。SE 法是一种常用提取烟草香味物质的方法，但共存基体成分复杂，影响香味成分的准确定量。SDE法集提取、蒸馏和萃取于一身，是目前烟草香味成分测定的常用预处理方法，但由于该方法需高温蒸馏，易引起烟草中糖类和氨基酸发生梅拉德（Maillard）反应，生成香味成分，影响烟草中的糠醛、呋喃类等焦甜香香味成分的测定，使得测定结果与烟草实际含量存在偏差。LC-MS/MS法[7-8]可直接分析样品提取液中香味成分。但样品提取液中含有大量糖基体，影响香味成分的质谱定量。
笔者利用糖基体的色谱保留时间小于香味成分，在柱后分离糖基体，避免其进入质谱仪，消除糖基体对香味成分离子化的影响，旨在建立LC-MS/MS方法定量测定烟草中香味成分。
1 材料與方法
1.1 试材
烤烟（云烟100）；二氯甲烷、甲醇、乙酸铵、乙腈（色谱纯，美国Tedia试剂公司）；一次性针头过滤器（0.22 μm有机系，国药集团化学试剂有限公司）。5种香味物质标样：β-紫罗兰酮、甲基环戊烯醇酮、γ-丁内酯、2-乙酰呋喃、4-羟基-2，5-二甲基呋喃酮（纯度均大于98%，英国Alfa Aesar 公司）。
1.2 仪器
Waters Acquity 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AL204-IC型电子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士 Mettler Toledo 公司）；API 4000 QTRAP质谱仪（美国应用生物系统公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。
1.3 标准溶液的配制
分别准确称取香味物质标样各0.2 g，用甲醇配制成20 μg/mL的标准储备溶液，逐步稀释成不同浓度标准工作溶液。
1.4 样品处理与分析
使用0.3 μg/mL各物质标准溶液对色谱和质谱条件进行优化，方法优化完成后，再对样品前处理过程进行优化（超声辅助温度和时间、萃取溶剂），最后采用基体柱切换技术进样分析。
准确称取1 g烟末于50 mL锥形瓶中，加入20 mL甲醇，在室温下超声萃取30 min，转移至50 mL离心管中，3 000 r/min下离心5 min，取上清液经0.22 μm有机系滤膜过滤后LC-MS/MS分析。
1.5 色谱质谱分析条件
色谱柱：Nova-Pak C18色谱柱（4 μm，3.9 mm×150 mm，美国Waters公司）；流动相：A相为0.1%乙酸铵水溶液，B相为甲醇；流速0.4 mL/min。梯度洗脱条件：0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A。柱温20 ℃，进样量5 μL。 质谱电喷雾正离子模式（ESI+），电喷雾电压4 500 V，离子源温度500 ℃；离子源辅助气1：275.79 kPa，离子源辅助气2：275.79 kPa。
2 结果与分析
2.1 LC-MS/MS方法优化
2.1.1 色谱条件优化。
分别以水或0.1%乙酸铵水溶液为流动相A，以乙腈或甲醇为流动相B，研究在不同洗脱梯度下测定2 μg/mL混合标准样品的分离效果。结果表明，当流动相A为0.1%乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇，洗脱条件为0 min，100% A；8 min，70% A；16 min，40% A；24 min，20% A；30 min，0% A；35 min，100% A；40 min，100% A时各化合物可完全分离。
2.1.2 质谱条件优化。
采用ESI源自动注射泵进样手动优化多反应监测扫描（MRM）定量方法。连续注射300 ng/mL各种物质标准溶液进行Q1全扫描确定母离子，采用Q2碎片离子扫描确定子离子，然后依次优化去簇电压（DP）和碰撞能量（CE），以提高灵敏度使得信号稳定。最终选定定量离子对和最佳质谱检测条件见表1。
2.2 前处理条件优化
2.2.1 萃取溶剂的选择。
分别研究甲醇、乙醇、乙腈作为提取试剂对香味物质提取效率的影响，结果如图1所示。由图1可知，乙醇提取效率最低，乙腈次之，甲醇提取效率最高，因此选择甲醇作为香味成分的提取试剂。
2.2.2 萃取条件的选择。
以甲醇为提取剂，考察了超声辅助萃取的温度和时间对提取效率的影响。结果表明，萃取温度（20～50 ℃）对提取效果影响不大，且温度过高对香味物质会产生影响。提取效率随着时间延长而增加（图2），当萃取时间到达30 min时，提取效率最高，之后无明显变化。因此，选择萃取温度和时间分别为20 ℃和30 min。
2.3 工作曲线、检测限和定量限
准确配制系列混合标准溶液，按照“2.1”优化后的条件进行定量分析，以各标样成分峰面积（y）对相应的浓度（x，ng/L）进行线性回归分析，得到标准曲线方程、线性范围及决定系数（表2）。由表2可知，各目标化合物相关性良好，适合定量分析。
2.4 样品分析
在上述优化条件下对同一烟草样品平行测定6次，结果见表3。将一定量的混合标样加到烟草样品中，加标样品和未加标样品平行进行前处理和定量分析。由表3可知，加标回收率为82.43%～95.77%，RSD为2.00%～4.58%。
2.5 基质效应
采用甲醇提取烟草中香味物质成分LC-MS/MS定量，具有操作简便、环境友好等优点，但此法一个显著缺点是存在基体干扰，基体中的干扰组分在电喷雾液滴表面离子化过程中与待测组分产生竞争，从而影响了电喷雾的离子化效率，即待测组分离子化效率与进入电喷雾离子源的基体有密切关系。如图3可见，香味物质信号随葡萄糖增加而显著下降。
从葡萄糖和各香味物质选择离子流色谱图（图4）可以看出，葡萄糖保留时间在5 min之前，而各香味成分保留时间在10 min之后，因此可以利用保留时间的不同，对干扰成分和目标成分进行分离处理。
圖5所示的是样品经甲醇超声提取后直接进样分析结果，葡萄糖对待测组分信号产生极大的干扰，γ-丁内酯和4-羟基-2，5-二甲基呋喃酮基线升高，β-紫罗兰酮、2-乙酰呋喃、甲基环戊烯醇酮信号较弱且杂峰较多。该研究根据葡萄糖和香味成分保留时间差值较大，采用基体柱后分离技术，在2 min时使用切换阀把糖分切入废液瓶，向质谱里通入甲醇溶剂，5 min时把切换阀切回至原来位置，使香味成分进入质谱进行测定，这样可消除糖引起的基质效应，结果如图6所示，待测组分信号显著增强。
3 结论
该研究利用糖基体的色谱保留时间小于香味成分，建立了基体柱切换-高效液相色谱串联质谱法直接测定烟草中弱极性香味成分方法。该方法可以有效消除香味成分测定过程中的假阳性问题，消除了基质抑制的现象，并免除了样品衍生化处理过程，具有前处理过程简单、省时和重复性好且灵敏度高等优点，适用于烟草中香味成分的快速、准确测定。
参考文献
[1] 周冀衡，朱小平，王彦亭，等.烟草生理与生物化学[M].合肥：中国科学技术大学出版社，1996.
[2] FUJIMORI T，KASUGA R，MATSUSHITA H，et al.Netural aroma constituents in burley tobacco[J].Agricultural and biological chemistry，1979，40（2）：303-315.
[3] 黄兰，徐迎波，田振峰，等.气相色谱-质谱/选择离子监测法分析烟草中的重要香味物质[J].烟草科技，2012（1）：34-42.
[4] DING Y，ZHU L J，LIU S M，et al.Analytical method of free and conjugated neutral aroma components in tobacco by solvent extraction coupled with comprehensive twodimensional gas chromatographytimeofflight mass spectrometry[J].Journal of chromatography A，2013，1280：122-127.
[5] KIM K R，ZLATKIS A，PARK J W，et al.Isolation of essential oils from tobacco by gas co-distillation/solvent extraction[J].Chromatographia，1982，15（9）：559-563.
[6] 吴鸣，赵明月，赵晓东，等.几种国内外混合型卷烟烟丝中香味物质的分析比较[J].中国烟草学报，2002，8（4）：1-9.
[7] 吴新华，朱瑞芝，任卓英，等.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法分离鉴定烟草中5种糖苷类香味前体物质[J].色谱，2009，27（6）：820-824.
[8] ASZYK J，KUBICA P，KOTWASIK A，et al.Comprehensive determination of flavouring additives and nicotine in ecigarette refill solutions.Part I：Liquid chromatographytandem mass spectrometry analysis[J].Journal of chromatography A，2017，1519：45-54.