目的 通过构建钠-氢交换蛋白1(NHE-1)小干扰RNA(siRNA)抑制肾小管上皮细胞NHE-1的表达,探讨其对细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制.方法 根据人NHE-1全长基因序列设计并合成NHE-1-siRNA,转染人肾小管上皮细胞系(HKC),以无关siRNA转染组作为对照.利用10 μmol/L抗霉素A诱导细胞来模拟缺血缺氧环境.用RT-PCR、Western印迹法检测NHE-1的表达.用BCECF/AM、Fluo-3/AM和SBFI-AM标记HKC,通过激光共聚焦显微镜分别检测其细胞内pHi、Ca2+和Na+浓度的变化.用Hoechst 33342染色技术及AnnexinV/PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况.利用荧光探针JC-1检测细胞线粒体膜电位的变化.结果 特异性NHE-1-siRNA能有效抑制HKC的NHE-1表达,与无关siRNA转染组相比,NHE-1-siRNA转染组NHE-1 mRNA和蛋白表达水平明显下调(均P＜0.05).抗霉素A刺激后,2组细胞NHE-1 mRNA及蛋白表达水平显著上调,而NHE-1-siRNA转染组低于无关siRNA转染组;同时NHE-1-siRNA转染组细胞凋亡率(8.9%±2.9%)明显低于抗霉素A处理组(18.8%±3.2%)和抗霉素A+无关siRNA转染组(17.4%±3.6%)(均P＜0.05):NHE-1-siRNA转染组线粒体膜电位明显增高;与无关siRNA转染组相比较,NHE-1-siRNA转染组经抗霉素A处理后,细胞内钠离子、氢离子及钙离子增高的幅度较低(P＜0.05).结论 NHE-1-siRNA可抑制肾小管上皮细胞内NHE-1的表达,对抗霉素A诱导肾小管上皮细胞的缺血再灌性损伤有一定的保护作用.其机制可能通过抑制NHE-1表达,延缓细胞内Na+的积聚,减轻细胞内钙离子的超载,抑制损伤细胞的线粒体膜电位下降,减少细胞的凋亡。
钠-氢交换蛋白1小干扰RNA对抗霉素A诱导人肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的保护机制
【摘 要】
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目的 通过构建钠-氢交换蛋白1(NHE-1)小干扰RNA(siRNA)抑制肾小管上皮细胞NHE-1的表达,探讨其对细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制.方法 根据人NHE-1全长基因序列设计并合成NHE-1-siRNA,转染人肾小管上皮细胞系(HKC),以无关siRNA转染组作为对照.利用10 μmol/L抗霉素A诱导细胞来模拟缺血缺氧环境.用RT-PCR、Western印迹法检测NHE-1的表达.用
【机 构】
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100853,北京,解放军总医院肾脏病研究所暨全军重点实验室,100853,北京,解放军总医院肾脏病研究所暨全军重点实验室,100853,北京,解放军总医院肾脏病研究所暨全军重点实验室,100853,
【出 处】
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中华肾脏病杂志
【发表日期】
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2008年24期
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