微小RNA-21-5p拮抗Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的分子机制

• 作 者: 覃松 陈淼 戢慧 刘国跃 陈涛 李康 梅鸿
• 机 构: 563003 贵州遵义，遵义医学院附属医院重症医学科,563003 贵州遵义，遵义医学院附属医院重症医学科,563003 贵州遵义，遵义医学院附属医院重症医学科,563003 贵州遵义，遵义医学院附属
• 出 处: 中华危重病急救医学
• 发表日期: 2015年27期
• 关键词: TypeⅡ alveolar epithelial cell Apoptosis MicroRNA miR-21-5p Molecule mechanism

目的

通过腺病毒过表达微小RNA-21-5p（miR-21-5p）后转染Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ），观察其对过氧化氢（H₂O₂）诱导的AECⅡ细胞凋亡的影响，并探索其抗凋亡的分子机制。

方法

将传代培养的大鼠AECⅡ随机均分为4组：正常对照组（生理盐水）、H₂O₂损伤组（0.5 mmol/L H₂O₂）、miR-21-5p过表达组（miR-21-5p腺病毒+ 0.5 mmol/L H₂O₂）、 miR-21-5p阴性转染组（空腺病毒+ 0.5 mmol/L H₂O₂）。采用透射电镜及流式细胞仪分别检测细胞凋亡形态及早期凋亡率；取转染效率最高的时间点（6、 12、 24、 48 h），采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测AECⅡ内miR-21-5p表达水平，蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞内Bcl-2、Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的蛋白表达。

结果

① AECⅡ鉴定：荧光显微镜下可见AECⅡ的特征性结构（微绒毛及嗜锇性板层小体）。②细胞凋亡形态：透射电镜下可见AECⅡ胞质回缩，染色质凝聚、边聚，细胞表面微绒毛稀少，嗜锇性板层小体排空。③ AECⅡ内miR-21-5p表达：48 h miR-21-5p腺病毒转染效率最高。miR-21-5p过表达组AECⅡ细胞中miR-21-5p表达量明显高于H₂O₂损伤组和miR-21-5p阴性转染组（A值：1.54±0.02比1.02±0.02、 0.56±0.03、 0.58±0.02，均P<0.05）。④细胞凋亡率：与正常对照组比较，H₂O₂损伤组、miR-21-5p阴性转染组和miR-21-5p过表达组细胞凋亡率均随损伤时间的延长逐渐升高。除损伤6 h外，miR-21-5p过表达组细胞凋亡率明显低于H₂O₂损伤组和miR-21-5p阴性转染组〔12 h：（10.73±2.80）%比（16.26±0.59）%、 （16.04±0.70）%， 24 h：（16.00±3.44）%比（23.29±2.78）%、 （23.58±2.31）%， 48 h：（31.30±3.55）%比（50.53±2.17）%、（49.41±1.97）%，均P<0.05〕；miR-21-5p阴性转染组与H₂O₂损伤组各时间点比较差异均无统计学意义。⑤蛋白表达：miR-21-5p过表达组AECⅡ细胞Bax、caspase-3蛋白表达明显低于H₂O₂损伤组和miR-21-5p阴性转染组〔Bax（A值）：0.07±0.01比0.18±0.01、 0.13±0.01，caspase-3（A值）：0.07±0.01比0.23±0.01、 0.12±0.01，均P<0.05〕，Bcl-2蛋白表达水平明显高于H₂O₂损伤组和miR-21-5p阴性转染组（A值：0.26±0.01比0.06±0.01、 0.10±0.01，均P<0.05）。

结论

① miR-21-5p具有抗AECⅡ凋亡的作用。②腺病毒载体是转染AECⅡ的一种比较成功的基因转导载体。③ miR-21-5p抗AECⅡ凋亡可能与下调Bax、caspase-3蛋白表达水平及上调Bcl-2蛋白表达水平有关。