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中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，海南儋州 571737
摘 要 GSK3蛋白與进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。GSK3是否在橡胶树JA和ET信号途径起作用尚不清楚。qPCR分析结果表明，机械伤害、MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树JA和ET植物激素信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达的调节具有协同作用。
关键词 茉莉酸甲酯；乙烯；巴西橡胶树；HbGSK1；表达分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Effects of Exogenous Jasmonates and Ethylene on the Expression of HbGSK1 in the Latex of Hevea brasiliensis Müll. Arg.
YANG Shuguang， ZHANG Shixin， WU Shaohua， CHEN Yueyi， LI Yan， SHI Minjing， TIAN Weimin*
Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Rubber Biology， Minstry of Agriculture /State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China
Abstract Recent studies have revealed that plant GSK3 proteins are actively implicated in hormonal signalling networks during development as well as in biotic and abiotic stress responses. Whether GSK in rubber trees functions in jasmonates and ethylene signaling is unknown. In this study， a real-time PCR analysis showed that the expression of HbGSK1 was upregulated by mcchanical wounding， methy jasmonates and ethylene. Moreover， the influence on HbGSK1 expression of “wounging+methy jasmonates” was greater than that of wounding， suggesting that wounding upregulates the expression of HbGSK1 by facilitates the biosynthesis of endogenesis jasmonates. The change of HbGSK1 transcript levels in latex indicated that HbGSK1 protein was involved in abiotic stress responses as well as in jasmonates and ethylene signaling of rubber trees. In addition， JA and ET operate synergistically in regulating HbGSK1 expression.
Key words methy jasmonates； ethylene； Hevea brasiliensis Müll. Arg.； HbGSK1； expression analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.012
植物GSK3（糖原合成酶激酶3）蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。在拟南芥中，AtSK12[1-2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5， 11]、AtSK23[5， 11]、AtSK32[12]调节BR信号传导，AtSK21[13-14]调节ABA信号传导，AtSK21[15-16]、AtSK31[17]调节生长素信号传导，AtSK21介导BR-ABA[14， 18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信号途径的交叉传导；在水稻中，OsSK21[19-20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]调节BR信号传导。
目前，模式植物拟南芥和水稻的GSK3s报道最多，其中，GSK3s调节激素信号途径的研究以BR信号途径最多，其次是生长素和脱落酸信号途径，GSK3s调节JA（茉莉酸）和ET（乙烯）信号途径的研究尚未见报道。在大戟科植物中，最近报道了ABA处理上调小桐子GSK3 JcGSK基因的表达[22]。 中国橡胶树植胶区位于北纬18～24曘的热带北缘和南亚热带地区，寒潮、台风和干旱是最为严重的自然灾害。因此，选育抗逆高产的橡胶树无性系是中国橡胶树育种的重要目标。在抗逆相关基因的研究基础上开发抗逆相关分子标记来辅助育种，将大幅提高抗逆性鉴定效率，推进抗逆品种的选育进程。JA和ET是橡胶树割胶过程中产生的2种重要的植物激素。在前期研究中，笔者们从胶乳中克隆到一个橡胶树GSK3基因HbGSK1（GenBank：JN835185.1），本研究分析MeJA和ET处理对胶乳中HbGSK1基因表达的影响，为进一步探讨橡胶树抗逆机理、开发抗逆分子标记、辅助橡胶树抗逆育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Müll.Arg.）无性系CATAS7-33-97，种植于中国热带农业科学院试验场。DNaseⅠ购自天根公司，反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Ferments公司，实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物公司，其它生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。引物合成由Invitrogen公司完成。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 選取大小、长势、物候期基本一致的成龄巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的未开割树和1年生橡胶树稳定期萌条开展实验。
（1）机械伤害和MeJA处理成龄未开割树：以成龄未开割树为材料，用刀片刮伤至皮层（2 cm×2 cm），对照涂上7.14%乙醇溶液：羊毛脂（1：1，V/m）的混合羊毛脂；处理涂上含0.14% MeJA的混合羊毛脂：含0.14% MeJA用7.14%乙醇溶解并混匀，分别在处理后0 h、6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d采样，针刺采胶，每个处理收集5株的混合样，用于提取胶乳总RNA。
（2）MeJA处理1年生橡胶树稳定期萌条：以1年生橡胶树稳定期萌条为材料，处理顶蓬节间，对照用7.14%的乙醇溶液处理，处理用含0.07% MeJA的7.14%乙醇溶液处理，分别在处理后2、6 h及1、3、5 d采样，用刀片切割韧皮部采胶，每个处理收集5株的混合样，用于提取胶乳总RNA。
（3）ET处理1年生橡胶树稳定期萌条：以1年生橡胶树稳定期萌条为材料，用0.05% ET处理顶蓬节间，对照不作任何处理，分别在处理后2 h、6 h、1 d、3 d、5 d采样，用刀片切割韧皮部采胶，每个处理收集5株的混合样，用于提取胶乳总RNA。
1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成 胶乳总RNA提取参照曾日中等[23]的方法。cDNA第一链的合成参照反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit的说明书进行。
1.2.3 生物信息学分析 利用DNAMAN软件对HbGSK1蛋白序列进行比对分析；从NCBI数据库下载拟南芥和水稻的GSK3s蛋白序列，首先用ClustalW进行序列多重比对，再利用MEGA4.0软件，选择neighbour -joining（NJ）模型，并进行1 000次bootstrap统计学检验，构建包括HbGSK1蛋白序列在内的植物GSK3蛋白的系统进化树；利用Prosite在线数据库分析蛋白的功能位点；利用NetPhos2.0 Server在线软件分析蛋白的磷酸化位点。
1.2.4 荧光定量PCR分析 根据获得的HbGSK1 cDNA全长序列设计qPCR引物（F：GAGTAGTATTCCAGGCTAAGTG，R：TAGTTTGCAGCTCACGGTTCTT），以Hb18S（F：GCTCGAAGACGATCAGATACC，R：TTCAGCCTTGCGACCATAC）作为内参基因，分析HbGSK1的基因表达。取1 μg胶乳总RNA反转录合成cDNA第一链，稀释10倍后作为荧光定量PCR分析的模板。qPCR反应体系为20 μL，其中2x SYBR Premix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物浓度为10 μmol/L，反应体系中每条引物终浓度均为0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反应在Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR仪中进行，实验操作按仪器使用说明书进行，qPCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；40个循环后进行溶解曲线分析。利用CFXmanager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析。
1.3 数据处理
用Excel 2003作图，用SPSS软件的R-E-G-WQ（Q）检验进行多重比较分析：标有不同大写字母者表示组间差异极显著（p<0.01），标有不同小写字母者表示组间差异显著（p<0.05），而标有相同小写字母者表示组间差异不显著（p>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）进行成对比较分析：p<0.01表示组间差异极显著，p<0.05表示组间差异显著。根据Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq计算基因的表达值。
2 结果与分析
2.1 HbGSK1蛋白功能位点分析
NetPhos 2.0 Server磷酸化位分析结果发现，HbGSK1蛋白共有56个可能的磷酸化位点[17个丝氨酸（Serine）位点、24个苏氨酸（Threonine）位点和15个酪氨酸（Tyrosine）位点]，其中13个磷酸化位点的预测得分大于0.500，包括5个丝氨酸位点（Ser：10、135、232、278、364，Score分别为0.845、0.901、0.861、0.843、0.819），4个苏氨酸位点（Thr：43、117、137、347，Score分别为0.799、0.831、0.949、0.705），4个酪氨酸位点（Tyr：110、143、233、305，Score分别为0.520、0.957、0.710、0.835）（见表1）。Prosite分析结果发现，HbGSK1蛋白序列含有5类功能位点：包括1个酪氨酸激酶磷酸化位点（tyrosine kinase phosphorylation site）：Tyr110，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（casein kinase II phosphorylation site）：Ser135/278、Thr43/137/253/294/347，5个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylationsite）：Ser128/220/364、Thr117/137，4个豆蔻酰化位点（N-myristoylation site）和3个N-糖基化位点（N-glycosylation site）（表1）。 2.2 氨基酸序列比对及进化树构建
由表2可知，拟南芥和水稻的GSK3s蛋白分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种类型，推导的HbGSK1氨基酸序列与拟南芥和水稻的GSK3s蛋白序列构建系统进化树显示，橡胶树HbGSK1与拟南芥（AtSK11、AtSK12、AtSK13）和水稻（OsSK11、OsSK12、OsSK13）的亚组Ⅰ聚为一类，亲缘关系最近（图1）。
人类hGSK3β分别与拟南芥GSK3代表AtSK21/BIN2和橡胶树GSK3 HbGSK1的比对结果显示，HbGSK1蛋白序列与hGSK3β和AtSK21/BIN2蛋白的序列相似性分别为56.26%、72.59%，并且STKc激酶结构域和关键的活性调节位点高度保守，说明该基因在物种进化过程中高度保守。如图2所示，黑下划线（_）表示STKc激酶结构域（hGSK3β：56-344；HbGSK1：73-357，AtSK21/BIN2：40-328）；虚下划线（﹍）表示植物中保守的TREE结构域（HbGSK1：294-297；AtSK21/BIN2：261-264），点突变处理拟南芥时TREE结构域第一、三、四位残基引起AtSK21/BIN2功能获得性点突变等位基因[bin2-1和dwf12-2D（E263K）；bin2-2（T261I）；ucu1-1，ucu1-2和dwf12-1D（E264K）][24-26]；保守的酪氨酸残基（hGSK3β：Y216；AtSK21/BIN2：Y200；HbGSK1：Y233）用白箭头（▽）表示，其磷酸化对激酶活性是必需的；保守的磷酸盐结合残基（hGSK3β：Arg96、Arg180、Lys205；AtSK21/BIN2：Arg80、Arg164、Lys189；HbGSK1：Arg113、Arg197、Lys222）用星号（*）表示，它与初始磷酸化底物结合；拟南芥弱等位基因ucu1-3（P284S）用加号（⊕）表示；其他功能散失突变[11]用分界符表（§）示（G49D，C183Y，R312K；所有残基在hGSK3β中都是保守的）；死激酶突变bin2（K69R）用磅字符（﹟）表示，该突变抑制功能获得性突变；hGSK3β特异的Ser9（hGSK3β：Ser9；HbGSK1：Ser10）用黑色箭头（▼）表示，该残基对hGSK3β的抑制调节是必需的。
2.3 HbGSK1基因表达与分析
以18S基因为内参，qRT-PCR分析HbGSK1在巴西橡胶树胶乳中的基因表达情况。
2.3.1 机械伤害和茉莉酸甲酯（MeJA）上调次生胶乳中HbGSK1基因的表达 由图3可知，机械伤害处理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表达水平分别是处理0 h的5.50、11.45、15.95、26.49、2.74、1.85倍，处理3 d表达水平最高，7 d后恢复到未处理水平（p>0.05）；MeJA处理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表达水平分别是处理0 h的3.46、8.74、16.92、52.68、5.81、3.76倍，处理3 d表达水平最高，7 d后恢复到较低水平；处理后2 d以内（0 h、6 h、1 d、2 d），机械伤害和MeJA处理的基因表达水平差异不显著，处理超过2 d（3 d、7 d、15 d），MeJA处理的基因表达水平显著高于（p<0.01）机械伤害处理，表明外源MeJA在处理2 d后才进入植物体内发挥作用，并且MeJA处理短暂而大幅度上调次生胶乳中HbGSK1基因的表达。机械伤害和MeJA处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量而上调HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树非生物胁迫和JA信号途径的调节。
CK：伤害+羊毛脂；MeJA：伤害+含0.14% MeJA的羊毛脂；不同大写字母表示组间差异极显著（p<0.01）。下同。
CK： wounding + lanolin； JA： 0.14% MeJA + lanolin； The different capital letters indicate significance at T<0.01 level. The same as below.
2.3.2 茉莉酸甲酯（MeJA）上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达 由图4可知，MeJA处理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表达水平分别是对照的1.39、0.55、3.13、1.32、1.20倍（图4-B），处理1 d的表达水平最高；虽然2 h、6 h、3 d、5 d处理与对照间差异显著（p<0.01或p<0.05），但处理和对照的基因表达水平基本在0.5～1.0之间波动（图4-A），基因表达变化幅度也只有±0.5倍左右（图4-B）。TTEST分析结果表明，对照组（CK：2 h、6 h、3 d、5 d）与处理组（JA：2 h、6 h、3 d、5 d）表达水平间差异不显著（p>0.05）。MeJA處理短暂而大幅度上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树JA信号途径的调节。
2.3.3 乙烯（ET）上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达 由图5可知，ET处理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表达水平分别是对照的1.36、8.14、7.73、1.80、9.01倍（图5-B），其中处理5 d表达水平最高；HbGSK1基因的表达对ET处理敏感，处理后6 h的基因表达就大幅度上调，并一直维持在较高的水平（图5-A）；异常的是，处理后3 d的样品，虽然基因表达依然高于对照，但与前后时间点相比上调幅度大副减小，推测在大田处理过程中，这个时间点的样品受到其它环境因子的干扰，而这些环境因子恰巧又能影响HbGSK1基因的表达。ET处理上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树ET信号途径的调节。 3 討论
植物激素是胁迫响应的监视者[27]。除了在个体水平发挥关键作用，不同植物激素也交叉传导，以促进参与胁迫修复的任何一组基因或它们的调节因子的协调[28]。植物GSK3蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。在拟南芥中，AtSK12[1，2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5，11]、AtSK23[5，11]、AtSK32[12]调节BR信号传导，AtSK21[13，29]调节ABA信号传导，AtSK21[15，16]、AtSK31[17]调节生长素信号传导，AtSK21介导BR-ABA[14，18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信号途径的交叉传导；在水稻中，OsSK21[19，20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]调节BR信号传导。
已有研究结果表明，叶片损伤后紫花苜蓿GSK3蛋白WIN（Wound-induced Gene）的激酶活性被瞬时触发[30]，伤害后拟南芥AtSKs的基因表达有一定幅度的变化[31]。机械损伤处理上调小桐子幼苗JcGSK基因的表达[22]。本研究获得相似的结果，机械伤害上调橡胶树胶乳中HbGSK1的基因表达。MeJA减小而BR增加水稻叶片角，MeJA处理降低了BR信号转导及其目的基因的mRNA水平，表明MeJA抑制叶片角可能依赖于BR生物合成和BR信号转导途径，GSK3类激酶（BR信号转导的一个抑制因子）的LiCL诱导失活部分挽救了MeJA诱导的叶片角减小，暗示GSK3可能参与MeJA信号途径的调节[32]。在本研究中，MeJA上调橡胶树胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1参与JA信号途径的调节。JA和ET在调节防卫相关基因中协同运作[33-35]。本研究结果表明，MeJA和ET处理均上调橡胶树胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1参与MeJA和ET信号途径的调节，并且MeJA和ET协同诱导HbGSK1基因的表达。
4 结论
机械伤害和MeJA处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量而上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树JA和ET信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达调节具有协同作用。
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摘 要 GSK3蛋白與进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。GSK3是否在橡胶树JA和ET信号途径起作用尚不清楚。qPCR分析结果表明，机械伤害、MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树JA和ET植物激素信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达的调节具有协同作用。
关键词 茉莉酸甲酯；乙烯；巴西橡胶树；HbGSK1；表达分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Effects of Exogenous Jasmonates and Ethylene on the Expression of HbGSK1 in the Latex of Hevea brasiliensis Müll. Arg.
YANG Shuguang， ZHANG Shixin， WU Shaohua， CHEN Yueyi， LI Yan， SHI Minjing， TIAN Weimin*
Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Rubber Biology， Minstry of Agriculture /State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China
Abstract Recent studies have revealed that plant GSK3 proteins are actively implicated in hormonal signalling networks during development as well as in biotic and abiotic stress responses. Whether GSK in rubber trees functions in jasmonates and ethylene signaling is unknown. In this study， a real-time PCR analysis showed that the expression of HbGSK1 was upregulated by mcchanical wounding， methy jasmonates and ethylene. Moreover， the influence on HbGSK1 expression of “wounging+methy jasmonates” was greater than that of wounding， suggesting that wounding upregulates the expression of HbGSK1 by facilitates the biosynthesis of endogenesis jasmonates. The change of HbGSK1 transcript levels in latex indicated that HbGSK1 protein was involved in abiotic stress responses as well as in jasmonates and ethylene signaling of rubber trees. In addition， JA and ET operate synergistically in regulating HbGSK1 expression.
Key words methy jasmonates； ethylene； Hevea brasiliensis Müll. Arg.； HbGSK1； expression analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.012
植物GSK3（糖原合成酶激酶3）蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。在拟南芥中，AtSK12[1-2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5， 11]、AtSK23[5， 11]、AtSK32[12]调节BR信号传导，AtSK21[13-14]调节ABA信号传导，AtSK21[15-16]、AtSK31[17]调节生长素信号传导，AtSK21介导BR-ABA[14， 18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信号途径的交叉传导；在水稻中，OsSK21[19-20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]调节BR信号传导。
目前，模式植物拟南芥和水稻的GSK3s报道最多，其中，GSK3s调节激素信号途径的研究以BR信号途径最多，其次是生长素和脱落酸信号途径，GSK3s调节JA（茉莉酸）和ET（乙烯）信号途径的研究尚未见报道。在大戟科植物中，最近报道了ABA处理上调小桐子GSK3 JcGSK基因的表达[22]。 中国橡胶树植胶区位于北纬18～24曘的热带北缘和南亚热带地区，寒潮、台风和干旱是最为严重的自然灾害。因此，选育抗逆高产的橡胶树无性系是中国橡胶树育种的重要目标。在抗逆相关基因的研究基础上开发抗逆相关分子标记来辅助育种，将大幅提高抗逆性鉴定效率，推进抗逆品种的选育进程。JA和ET是橡胶树割胶过程中产生的2种重要的植物激素。在前期研究中，笔者们从胶乳中克隆到一个橡胶树GSK3基因HbGSK1（GenBank：JN835185.1），本研究分析MeJA和ET处理对胶乳中HbGSK1基因表达的影响，为进一步探讨橡胶树抗逆机理、开发抗逆分子标记、辅助橡胶树抗逆育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Müll.Arg.）无性系CATAS7-33-97，种植于中国热带农业科学院试验场。DNaseⅠ购自天根公司，反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Ferments公司，实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物公司，其它生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。引物合成由Invitrogen公司完成。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 選取大小、长势、物候期基本一致的成龄巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的未开割树和1年生橡胶树稳定期萌条开展实验。
（1）机械伤害和MeJA处理成龄未开割树：以成龄未开割树为材料，用刀片刮伤至皮层（2 cm×2 cm），对照涂上7.14%乙醇溶液：羊毛脂（1：1，V/m）的混合羊毛脂；处理涂上含0.14% MeJA的混合羊毛脂：含0.14% MeJA用7.14%乙醇溶解并混匀，分别在处理后0 h、6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d采样，针刺采胶，每个处理收集5株的混合样，用于提取胶乳总RNA。
（2）MeJA处理1年生橡胶树稳定期萌条：以1年生橡胶树稳定期萌条为材料，处理顶蓬节间，对照用7.14%的乙醇溶液处理，处理用含0.07% MeJA的7.14%乙醇溶液处理，分别在处理后2、6 h及1、3、5 d采样，用刀片切割韧皮部采胶，每个处理收集5株的混合样，用于提取胶乳总RNA。
（3）ET处理1年生橡胶树稳定期萌条：以1年生橡胶树稳定期萌条为材料，用0.05% ET处理顶蓬节间，对照不作任何处理，分别在处理后2 h、6 h、1 d、3 d、5 d采样，用刀片切割韧皮部采胶，每个处理收集5株的混合样，用于提取胶乳总RNA。
1.2.2 总RNA的提取与cDNA的合成 胶乳总RNA提取参照曾日中等[23]的方法。cDNA第一链的合成参照反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit的说明书进行。
1.2.3 生物信息学分析 利用DNAMAN软件对HbGSK1蛋白序列进行比对分析；从NCBI数据库下载拟南芥和水稻的GSK3s蛋白序列，首先用ClustalW进行序列多重比对，再利用MEGA4.0软件，选择neighbour -joining（NJ）模型，并进行1 000次bootstrap统计学检验，构建包括HbGSK1蛋白序列在内的植物GSK3蛋白的系统进化树；利用Prosite在线数据库分析蛋白的功能位点；利用NetPhos2.0 Server在线软件分析蛋白的磷酸化位点。
1.2.4 荧光定量PCR分析 根据获得的HbGSK1 cDNA全长序列设计qPCR引物（F：GAGTAGTATTCCAGGCTAAGTG，R：TAGTTTGCAGCTCACGGTTCTT），以Hb18S（F：GCTCGAAGACGATCAGATACC，R：TTCAGCCTTGCGACCATAC）作为内参基因，分析HbGSK1的基因表达。取1 μg胶乳总RNA反转录合成cDNA第一链，稀释10倍后作为荧光定量PCR分析的模板。qPCR反应体系为20 μL，其中2x SYBR Premix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物浓度为10 μmol/L，反应体系中每条引物终浓度均为0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反应在Bio-Rad公司的CFX实时荧光定量PCR仪中进行，实验操作按仪器使用说明书进行，qPCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；40个循环后进行溶解曲线分析。利用CFXmanager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析。
1.3 数据处理
用Excel 2003作图，用SPSS软件的R-E-G-WQ（Q）检验进行多重比较分析：标有不同大写字母者表示组间差异极显著（p<0.01），标有不同小写字母者表示组间差异显著（p<0.05），而标有相同小写字母者表示组间差异不显著（p>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）进行成对比较分析：p<0.01表示组间差异极显著，p<0.05表示组间差异显著。根据Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq计算基因的表达值。
2 结果与分析
2.1 HbGSK1蛋白功能位点分析
NetPhos 2.0 Server磷酸化位分析结果发现，HbGSK1蛋白共有56个可能的磷酸化位点[17个丝氨酸（Serine）位点、24个苏氨酸（Threonine）位点和15个酪氨酸（Tyrosine）位点]，其中13个磷酸化位点的预测得分大于0.500，包括5个丝氨酸位点（Ser：10、135、232、278、364，Score分别为0.845、0.901、0.861、0.843、0.819），4个苏氨酸位点（Thr：43、117、137、347，Score分别为0.799、0.831、0.949、0.705），4个酪氨酸位点（Tyr：110、143、233、305，Score分别为0.520、0.957、0.710、0.835）（见表1）。Prosite分析结果发现，HbGSK1蛋白序列含有5类功能位点：包括1个酪氨酸激酶磷酸化位点（tyrosine kinase phosphorylation site）：Tyr110，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（casein kinase II phosphorylation site）：Ser135/278、Thr43/137/253/294/347，5个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylationsite）：Ser128/220/364、Thr117/137，4个豆蔻酰化位点（N-myristoylation site）和3个N-糖基化位点（N-glycosylation site）（表1）。 2.2 氨基酸序列比对及进化树构建
由表2可知，拟南芥和水稻的GSK3s蛋白分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种类型，推导的HbGSK1氨基酸序列与拟南芥和水稻的GSK3s蛋白序列构建系统进化树显示，橡胶树HbGSK1与拟南芥（AtSK11、AtSK12、AtSK13）和水稻（OsSK11、OsSK12、OsSK13）的亚组Ⅰ聚为一类，亲缘关系最近（图1）。
人类hGSK3β分别与拟南芥GSK3代表AtSK21/BIN2和橡胶树GSK3 HbGSK1的比对结果显示，HbGSK1蛋白序列与hGSK3β和AtSK21/BIN2蛋白的序列相似性分别为56.26%、72.59%，并且STKc激酶结构域和关键的活性调节位点高度保守，说明该基因在物种进化过程中高度保守。如图2所示，黑下划线（_）表示STKc激酶结构域（hGSK3β：56-344；HbGSK1：73-357，AtSK21/BIN2：40-328）；虚下划线（﹍）表示植物中保守的TREE结构域（HbGSK1：294-297；AtSK21/BIN2：261-264），点突变处理拟南芥时TREE结构域第一、三、四位残基引起AtSK21/BIN2功能获得性点突变等位基因[bin2-1和dwf12-2D（E263K）；bin2-2（T261I）；ucu1-1，ucu1-2和dwf12-1D（E264K）][24-26]；保守的酪氨酸残基（hGSK3β：Y216；AtSK21/BIN2：Y200；HbGSK1：Y233）用白箭头（▽）表示，其磷酸化对激酶活性是必需的；保守的磷酸盐结合残基（hGSK3β：Arg96、Arg180、Lys205；AtSK21/BIN2：Arg80、Arg164、Lys189；HbGSK1：Arg113、Arg197、Lys222）用星号（*）表示，它与初始磷酸化底物结合；拟南芥弱等位基因ucu1-3（P284S）用加号（⊕）表示；其他功能散失突变[11]用分界符表（§）示（G49D，C183Y，R312K；所有残基在hGSK3β中都是保守的）；死激酶突变bin2（K69R）用磅字符（﹟）表示，该突变抑制功能获得性突变；hGSK3β特异的Ser9（hGSK3β：Ser9；HbGSK1：Ser10）用黑色箭头（▼）表示，该残基对hGSK3β的抑制调节是必需的。
2.3 HbGSK1基因表达与分析
以18S基因为内参，qRT-PCR分析HbGSK1在巴西橡胶树胶乳中的基因表达情况。
2.3.1 机械伤害和茉莉酸甲酯（MeJA）上调次生胶乳中HbGSK1基因的表达 由图3可知，机械伤害处理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表达水平分别是处理0 h的5.50、11.45、15.95、26.49、2.74、1.85倍，处理3 d表达水平最高，7 d后恢复到未处理水平（p>0.05）；MeJA处理6 h、1 d、2 d、3 d、7 d、15 d的基因表达水平分别是处理0 h的3.46、8.74、16.92、52.68、5.81、3.76倍，处理3 d表达水平最高，7 d后恢复到较低水平；处理后2 d以内（0 h、6 h、1 d、2 d），机械伤害和MeJA处理的基因表达水平差异不显著，处理超过2 d（3 d、7 d、15 d），MeJA处理的基因表达水平显著高于（p<0.01）机械伤害处理，表明外源MeJA在处理2 d后才进入植物体内发挥作用，并且MeJA处理短暂而大幅度上调次生胶乳中HbGSK1基因的表达。机械伤害和MeJA处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量而上调HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树非生物胁迫和JA信号途径的调节。
CK：伤害+羊毛脂；MeJA：伤害+含0.14% MeJA的羊毛脂；不同大写字母表示组间差异极显著（p<0.01）。下同。
CK： wounding + lanolin； JA： 0.14% MeJA + lanolin； The different capital letters indicate significance at T<0.01 level. The same as below.
2.3.2 茉莉酸甲酯（MeJA）上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达 由图4可知，MeJA处理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表达水平分别是对照的1.39、0.55、3.13、1.32、1.20倍（图4-B），处理1 d的表达水平最高；虽然2 h、6 h、3 d、5 d处理与对照间差异显著（p<0.01或p<0.05），但处理和对照的基因表达水平基本在0.5～1.0之间波动（图4-A），基因表达变化幅度也只有±0.5倍左右（图4-B）。TTEST分析结果表明，对照组（CK：2 h、6 h、3 d、5 d）与处理组（JA：2 h、6 h、3 d、5 d）表达水平间差异不显著（p>0.05）。MeJA處理短暂而大幅度上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树JA信号途径的调节。
2.3.3 乙烯（ET）上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达 由图5可知，ET处理2 h、6 h、1 d、3 d、5 d的基因表达水平分别是对照的1.36、8.14、7.73、1.80、9.01倍（图5-B），其中处理5 d表达水平最高；HbGSK1基因的表达对ET处理敏感，处理后6 h的基因表达就大幅度上调，并一直维持在较高的水平（图5-A）；异常的是，处理后3 d的样品，虽然基因表达依然高于对照，但与前后时间点相比上调幅度大副减小，推测在大田处理过程中，这个时间点的样品受到其它环境因子的干扰，而这些环境因子恰巧又能影响HbGSK1基因的表达。ET处理上调初生胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树ET信号途径的调节。 3 討论
植物激素是胁迫响应的监视者[27]。除了在个体水平发挥关键作用，不同植物激素也交叉传导，以促进参与胁迫修复的任何一组基因或它们的调节因子的协调[28]。植物GSK3蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。在拟南芥中，AtSK12[1，2]、AtSK21[3-10]、AtSK22[5，11]、AtSK23[5，11]、AtSK32[12]调节BR信号传导，AtSK21[13，29]调节ABA信号传导，AtSK21[15，16]、AtSK31[17]调节生长素信号传导，AtSK21介导BR-ABA[14，18]、BR-Auxin[15]、BR-GA[10]信号途径的交叉传导；在水稻中，OsSK21[19，20]、OsSK24[20]、OsSK22[21]调节BR信号传导。
已有研究结果表明，叶片损伤后紫花苜蓿GSK3蛋白WIN（Wound-induced Gene）的激酶活性被瞬时触发[30]，伤害后拟南芥AtSKs的基因表达有一定幅度的变化[31]。机械损伤处理上调小桐子幼苗JcGSK基因的表达[22]。本研究获得相似的结果，机械伤害上调橡胶树胶乳中HbGSK1的基因表达。MeJA减小而BR增加水稻叶片角，MeJA处理降低了BR信号转导及其目的基因的mRNA水平，表明MeJA抑制叶片角可能依赖于BR生物合成和BR信号转导途径，GSK3类激酶（BR信号转导的一个抑制因子）的LiCL诱导失活部分挽救了MeJA诱导的叶片角减小，暗示GSK3可能参与MeJA信号途径的调节[32]。在本研究中，MeJA上调橡胶树胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1参与JA信号途径的调节。JA和ET在调节防卫相关基因中协同运作[33-35]。本研究结果表明，MeJA和ET处理均上调橡胶树胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1参与MeJA和ET信号途径的调节，并且MeJA和ET协同诱导HbGSK1基因的表达。
4 结论
机械伤害和MeJA处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量而上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1可能参与橡胶树JA和ET信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达调节具有协同作用。
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