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摘 要：为了提高丹绿补肾胶囊的质量控制标准，采用高效液相色谱法，对其特征图谱进行了方法学考察。选用phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为220 nm，建立了丹绿补肾胶囊特征图谱。结果表明：在优化的色谱条件下，丹绿补肾胶囊中的各成分得到了较好分离，以胡椒碱为参照峰，确定了7个共有峰，计算得出了各特征峰与S峰的相对保留时间。10批共有峰相对保留时间的RSD值均小于1.0%，相对峰面积的RSD值均小于2.0%。所建立的特征图谱能较好地评价丹绿补肾胶囊的产品质量，为提高该制剂的质量标准提供了数据基础。
关键词：中药药剂学;丹绿补肾胶囊;特征图谱;胡椒碱;高效液相色谱法
中图分类号：R917 文献标志码：A
HPLC specific chromatograms of Danlv Bushen capsules
WANG Wenpeng，ZHOU Yongyan，HAO Pengbin，ZHANG Yanyan，
LIU Jianwei，SUN Shengbin，JIANG Guozhi，LI Junshan
（Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China）
Abstract：In order to improve the quality control standard of Danlv Bushen capsule， the HPLC characteristic chromatogram of Danlv Bushen capsul is investigated by HPLC. Chromatographic conditions： The phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）chromatographic column and the mobile phase of acetonitrile-0.2% aqueous phosphoric acid are used for gradient elution with the flow rate at 1.0 mL/min and the detection wavelength at 220 nm. The column oven temperature is kept at 30 ℃，the characteristic map of Danlu Bushen capsule ias established. In the chromatographic conditions， the constituents of Danlv Bushen capsules show a good separation， seven common peaks are identified， and the relative retention time of the characteristic peaks and the S peaks is calculated. The RSD values of the 10 groups of common peak relative retention time are all less than 1%， and the relative peak area RSD values are less than 2%.The established characteristic atlas could evaluate the quality of Danlv Bushen capsule， and lay a foundation for improving the quality standard.
Keywords：pharmacy of traditional Chinese medicine; Danlv Bushen capsules; specific chromatograms; piperine; HPLC
丹綠补肾胶囊是由白花丹、射干、绿包藤、胡椒、干姜等经提取精制而制得的一种胶囊剂[1]，用于治疗男性形衰体弱、性欲低下甚或阳痿、遗精、不育等症状，还用于治疗女性未老先衰、容颜无华、颜面黑斑、月经不调、宫寒不孕等症状[1-4]。
现行的丹绿补肾胶囊质量标准较为简单，鉴别项中只对白花丹、绿包藤和胡椒碱进行控制，含量项中只对胡椒药材成分中的胡椒碱进行测定，难以有效控制丹绿补肾胶囊的质量[5]。近年来，在质量标准的相关研究中，指纹图谱和特征图谱分析技术因能体现中药整体特征而受到了广泛关注和认可[6-15]。为了合理地提高丹绿补肾胶囊制剂的质控标准，笔者对其HPLC特征图谱进行了方法学考察，并对实验结果进行了分析。
1 材 料
1.1 主要试剂与仪器
乙腈，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司提供;磷酸，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司提供。
Agilent 1260型高效液相色谱仪;SHB-Ⅲ循环水式真空泵，河南郑州长城科工贸有限公司提供;KH3200E型超声清洗器，江苏昆山禾创超声仪器有限公司提供;CPA225D电子天平，德国赛多利斯公司提供。
1.2 样品与对照品
丹绿补肾胶囊10批，批号分别为15070551，15070651，15070751，15101161，15101261，15101361，16051651，16051751，16051851，16051951，云南神威施普瑞药业有限公司提供。 射干苷对照品，批号为111632-200602;胡椒碱对照品，批号为110775-201405;次野鸢尾黄素对照品，批号为111557-200602。对照品均购于中国食品药品检定研究院。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：phenomenex Luna C18（2） （4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.2%（质量分数，下同）磷酸（B），梯度洗脱（0～25 min，10%A→15%A;25～65 min，25%A→70%A）;检测波长220 nm;柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;进样量10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 参照物溶液
取绿包藤对照药材、射干苷对照药材各1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声处理60 min，取出，放冷，摇匀，过滤。取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取射干苷对照品、次野鸢尾黄素对照品和胡椒碱对照品适量，用甲醇分别制成每1 mL含 20.0，40.0，80.0 μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
2.2.2 供试品溶液
精密称定丹绿补肾胶囊内容物0.35 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量;超声处理30 min，放冷后再称定质量。用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
取同一批样品（批号为16051951），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次进行测定，记录色谱图，以胡椒碱为S峰。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于04%，相对峰面积的RSD值均小于1.9%。
2.3.2 稳定性试验
取同一批样品（批号为16051951），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件在0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.5%，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于1.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
取同一批樣品（批号为16051951）6份，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别测定，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.2%，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于1.6%。
2.3.4 色谱峰归属
按处方制备绿包藤、射干苷阴性样品，分别按“222”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图。结果表明，1号、3号峰归属为绿包藤药材;2号、4号、5号、6号峰为射干药材;7号峰为胡椒药材。
2.4 特征图谱
2.4.1 特征图谱的建立
精密吸取参照物溶液10 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，得到参照物HPLC图谱（见图1）。精密称定10批丹绿补肾胶囊样品适量，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进行分析，建立特征图谱（见图2）。
图1 混合对照品图谱
2 4 2 特征图谱共有色谱峰的标定
取10批丹绿补肾胶囊的供试品溶液，分别按“21”项色谱条件进样分析，采集色谱图，对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，10批共有峰相对保留时间的RSD值均小于10%，相对峰面积的RSD值均小于20%。将10批溶液的色谱图按照《中药色谱特征图谱相似度评价系统》（2008版）对保留时间0～65 min的色谱峰进行分析，选择稳定性、重复性好及特征明显的色谱峰为共有峰，共标记7个共有峰。选定这7个共有峰进行谱峰匹配，设定标准模板，并以此共有模式为标准，建立了丹绿补肾胶囊HPLC特征图谱。同时经对照品指认，确定了3个色谱峰，即射干苷（2号峰）、次野鸢尾黄素（5号峰）、胡椒碱（7号峰），建立丹绿补肾胶囊特征图谱共有模式。
2 4 3 样品测定
取10批丹绿补肾胶囊样品，分别按“222”项方法制备供试品溶液，按“21”色谱条件进行检测，记录色谱图及各共有峰的峰面积，结果良好，详见图3。
3 结果与讨论
1）丹绿补肾胶囊中所含的成分较多，为了保证样品的充分提取，通过采用不同浓度的甲醇进行超声、回流选择性实验，发现加甲醇适量、超声30 min的提取效果最佳。通过用甲醇-0.2%磷酸、乙腈-02%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，对不同柱温（25，30，35 ℃）、不同流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）进行筛选，最终优化得到了本文的色谱条件。在此优化条件下，各色谱峰分离效果较好，可用于丹绿补肾胶囊特征图谱的分析。
2）采用HPLC梯度洗脱法对丹绿补肾胶囊进行研究，建立了丹绿补肾胶囊特征图谱，制剂中药材的主要色谱峰在220 nm处均能体现，且在此波长处监测的色谱峰数量较多，响应值较好，故选择220 nm作为检测波长。在此波长处，3种药材均有特征峰呈现，根据峰归属结果，绿包藤的特征峰为1号和3号峰，射干苷的特征峰为2号、4号、5号和6号峰，胡椒碱的特征峰为7号峰。
3）建立了丹绿补肾胶囊的液相特征图谱，系统地反映了丹绿补肾胶囊化学成分的全貌。该图谱方法的建立可作为丹绿补肾胶囊的质量控制方法，通过对丹绿补肾胶囊进行分析，找出了7个共有峰。选取胡椒碱的峰作为参照峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，相对保留时间应在（规定值±5）之内。规定值为 0.188（峰1），0.460（峰2），0.634（峰3），0802（峰4），0.908（峰5），0.938（峰6），1.000（峰7）。 4）本研究采用高效液相色谱法对丹绿补肾胶囊的多种指标性成分进行测定，建立了丹绿补肾胶囊的特征图谱，弥补了现有技术无法全面反映产品质量状况的不足，使该产品的质量控制技术更加完善、科学，为今后的标准化生产提供了一种可利用的质量控制模式。目前的研究只定位了射干苷、次野鳶尾黄素和胡椒碱3个色谱峰，后期将进一步开展对其他峰成分的全面考察。
参考文献/References：
[1] 薛慈民，朱琦，徐兆东.勐龙胶囊治疗阳痿30例[J].中国新药杂志，2000，9（7）：486-488.
XUE Cimin，ZHU Qi，XU Zhaodong.Clinical validating the efficacy of Menglong capsules in 30 patients with impotence[J].Chinese New Drugs Journal， 2000，9（7）：486-488.
[2] 潘天明，庄申榕，黄毅.勐龙胶囊治疗勃起功能障碍60例[J].中国新药杂志，2000，9（7）：488-489.
[3] 邓庶民，万奔，王建业，等.勐龙胶囊治疗勃起功能障碍61例[J].中国新药杂志，2000，9（7）：484-486.
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[4] 陈革庆.治疗男性勃起障碍的新药勐龙胶囊[J] .中国新药杂志，2000，9（7）：489-490.
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关键词：中药药剂学;丹绿补肾胶囊;特征图谱;胡椒碱;高效液相色谱法
中图分类号：R917 文献标志码：A
HPLC specific chromatograms of Danlv Bushen capsules
WANG Wenpeng，ZHOU Yongyan，HAO Pengbin，ZHANG Yanyan，
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Abstract：In order to improve the quality control standard of Danlv Bushen capsule， the HPLC characteristic chromatogram of Danlv Bushen capsul is investigated by HPLC. Chromatographic conditions： The phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）chromatographic column and the mobile phase of acetonitrile-0.2% aqueous phosphoric acid are used for gradient elution with the flow rate at 1.0 mL/min and the detection wavelength at 220 nm. The column oven temperature is kept at 30 ℃，the characteristic map of Danlu Bushen capsule ias established. In the chromatographic conditions， the constituents of Danlv Bushen capsules show a good separation， seven common peaks are identified， and the relative retention time of the characteristic peaks and the S peaks is calculated. The RSD values of the 10 groups of common peak relative retention time are all less than 1%， and the relative peak area RSD values are less than 2%.The established characteristic atlas could evaluate the quality of Danlv Bushen capsule， and lay a foundation for improving the quality standard.
Keywords：pharmacy of traditional Chinese medicine; Danlv Bushen capsules; specific chromatograms; piperine; HPLC
丹綠补肾胶囊是由白花丹、射干、绿包藤、胡椒、干姜等经提取精制而制得的一种胶囊剂[1]，用于治疗男性形衰体弱、性欲低下甚或阳痿、遗精、不育等症状，还用于治疗女性未老先衰、容颜无华、颜面黑斑、月经不调、宫寒不孕等症状[1-4]。
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1 材 料
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1.2 样品与对照品
丹绿补肾胶囊10批，批号分别为15070551，15070651，15070751，15101161，15101261，15101361，16051651，16051751，16051851，16051951，云南神威施普瑞药业有限公司提供。 射干苷对照品，批号为111632-200602;胡椒碱对照品，批号为110775-201405;次野鸢尾黄素对照品，批号为111557-200602。对照品均购于中国食品药品检定研究院。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：phenomenex Luna C18（2） （4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.2%（质量分数，下同）磷酸（B），梯度洗脱（0～25 min，10%A→15%A;25～65 min，25%A→70%A）;检测波长220 nm;柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;进样量10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 参照物溶液
取绿包藤对照药材、射干苷对照药材各1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声处理60 min，取出，放冷，摇匀，过滤。取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取射干苷对照品、次野鸢尾黄素对照品和胡椒碱对照品适量，用甲醇分别制成每1 mL含 20.0，40.0，80.0 μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
2.2.2 供试品溶液
精密称定丹绿补肾胶囊内容物0.35 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量;超声处理30 min，放冷后再称定质量。用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
取同一批样品（批号为16051951），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次进行测定，记录色谱图，以胡椒碱为S峰。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于04%，相对峰面积的RSD值均小于1.9%。
2.3.2 稳定性试验
取同一批样品（批号为16051951），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件在0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.5%，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于1.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
取同一批樣品（批号为16051951）6份，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别测定，记录色谱图。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于0.2%，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于1.6%。
2.3.4 色谱峰归属
按处方制备绿包藤、射干苷阴性样品，分别按“222”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图。结果表明，1号、3号峰归属为绿包藤药材;2号、4号、5号、6号峰为射干药材;7号峰为胡椒药材。
2.4 特征图谱
2.4.1 特征图谱的建立
精密吸取参照物溶液10 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，得到参照物HPLC图谱（见图1）。精密称定10批丹绿补肾胶囊样品适量，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进行分析，建立特征图谱（见图2）。
图1 混合对照品图谱
2 4 2 特征图谱共有色谱峰的标定
取10批丹绿补肾胶囊的供试品溶液，分别按“21”项色谱条件进样分析，采集色谱图，对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，10批共有峰相对保留时间的RSD值均小于10%，相对峰面积的RSD值均小于20%。将10批溶液的色谱图按照《中药色谱特征图谱相似度评价系统》（2008版）对保留时间0～65 min的色谱峰进行分析，选择稳定性、重复性好及特征明显的色谱峰为共有峰，共标记7个共有峰。选定这7个共有峰进行谱峰匹配，设定标准模板，并以此共有模式为标准，建立了丹绿补肾胶囊HPLC特征图谱。同时经对照品指认，确定了3个色谱峰，即射干苷（2号峰）、次野鸢尾黄素（5号峰）、胡椒碱（7号峰），建立丹绿补肾胶囊特征图谱共有模式。
2 4 3 样品测定
取10批丹绿补肾胶囊样品，分别按“222”项方法制备供试品溶液，按“21”色谱条件进行检测，记录色谱图及各共有峰的峰面积，结果良好，详见图3。
3 结果与讨论
1）丹绿补肾胶囊中所含的成分较多，为了保证样品的充分提取，通过采用不同浓度的甲醇进行超声、回流选择性实验，发现加甲醇适量、超声30 min的提取效果最佳。通过用甲醇-0.2%磷酸、乙腈-02%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，对不同柱温（25，30，35 ℃）、不同流速（0.9，1.0，1.1 mL/min）进行筛选，最终优化得到了本文的色谱条件。在此优化条件下，各色谱峰分离效果较好，可用于丹绿补肾胶囊特征图谱的分析。
2）采用HPLC梯度洗脱法对丹绿补肾胶囊进行研究，建立了丹绿补肾胶囊特征图谱，制剂中药材的主要色谱峰在220 nm处均能体现，且在此波长处监测的色谱峰数量较多，响应值较好，故选择220 nm作为检测波长。在此波长处，3种药材均有特征峰呈现，根据峰归属结果，绿包藤的特征峰为1号和3号峰，射干苷的特征峰为2号、4号、5号和6号峰，胡椒碱的特征峰为7号峰。
3）建立了丹绿补肾胶囊的液相特征图谱，系统地反映了丹绿补肾胶囊化学成分的全貌。该图谱方法的建立可作为丹绿补肾胶囊的质量控制方法，通过对丹绿补肾胶囊进行分析，找出了7个共有峰。选取胡椒碱的峰作为参照峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，相对保留时间应在（规定值±5）之内。规定值为 0.188（峰1），0.460（峰2），0.634（峰3），0802（峰4），0.908（峰5），0.938（峰6），1.000（峰7）。 4）本研究采用高效液相色谱法对丹绿补肾胶囊的多种指标性成分进行测定，建立了丹绿补肾胶囊的特征图谱，弥补了现有技术无法全面反映产品质量状况的不足，使该产品的质量控制技术更加完善、科学，为今后的标准化生产提供了一种可利用的质量控制模式。目前的研究只定位了射干苷、次野鳶尾黄素和胡椒碱3个色谱峰，后期将进一步开展对其他峰成分的全面考察。
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