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目的通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H(endo-beta-N-acetylglucosaminidase H,Endo-H),并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P.pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P.pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可>95%。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳(DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis,DSA-FACE)分析核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNaseB)的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F(peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F)的糖基切割功能。结果利用P.pastoris表达制备EndoH,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSAFACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5GlcNAc-Man9GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5GlcNAc2-Man9GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P.pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。