【摘 要】
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目的:研究siRNA抑制Smad4基因表达治疗异位骨化大鼠模型的效果,并与抑制Runx2的疗效进行比较.方法:1、设计6条分别针对大鼠Smad4和Runx2的mRNA模板,用体外转录合成法分别合成
【机 构】
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北京大学首钢医院骨科,北京大学第三医院运动医学研究所,天津医院骨科
【基金项目】
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国家自然科学基金;国家体育总局科研项目;北京市科技新星计划
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目的:研究siRNA抑制Smad4基因表达治疗异位骨化大鼠模型的效果,并与抑制Runx2的疗效进行比较.方法:1、设计6条分别针对大鼠Smad4和Runx2的mRNA模板,用体外转录合成法分别合成6条siRNA,采用RT-PCR从mRNA水平在培养的原代成骨前体细胞中筛选有明显抑制作用的siRNA.2、设计合成针对Smad4基因和Runx2基因编码的发卡样siRNA的双链DNA,与腺病毒的穿梭质粒连接后,取其启动子和终止子连接于非病毒载体上.在培养的大鼠原代成骨细胞中,采用RT-PCR和western blot测定Smad4特异性siRNA非病毒对Smad4的抑制作用和Runx2特异性siRNA非病毒对Runx2的抑制作用.3、采用体内实验测定Smad4或Runx2特异性siRNA非病毒载体对切断大鼠跟腱诱导异位骨化动物模型的影响:实验组行跟腱切断术和植入100μg的Smad4-siRNA或Runx2-siRNA重组非病毒载体,对照组行跟腱切断术和植入100 μg的pcDNA4/HisA非病毒载体.10周后,行CT三位重建检测形成的异位骨大小,HE染色观察其组织形态.结果:1、在合成的3条Smad4-siRNA中,siRNA对Runx2的抑制效果最明显.2、成功构建重组非病毒载体,转染原代成骨细胞可明显抑制Smad4和Runx2的表达.3、CT_E位重建显示,Smad4-siRNA实验组形成的异位骨体积较对照组减小92%,Runx2-siRNA实验组形成的异位骨体积较对照组减小93%,差异均有统计学意义(P0.05).结论:Smad4和Runx2两种信号通路的特异性siRNA可以明显抑制切断跟腱诱导的异位骨化,但两种不同siRNA的抑制效果无差别.
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