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【目的】构建人脑源性神经营养因子（BDNF）基因真核表达载体，并在小鼠耳蜗毛细胞与螺旋神经节细胞（SGCs）表达。【方法】应用RT‐PCR从人外周血中扩增BDNF基因开放阅读框（ORF），采用 TA克隆技术，将目的片段插入到pUCm‐T载体中进行鉴定，重组的质粒命名为pUCm‐T‐BDNF。随后，将BDNF进一步克隆到真核表达载体pT racer‐CM V／Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pT racer‐CM V／Bsd‐BD‐NF质粒转染小鼠耳蜗SGCs细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，转染SGCs细胞，经杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选4周，用Western blot检测BDNF的表达。【结果】成功构建了pTracer‐CMV／Bsd‐BDNF真核表达质粒，转染SGCs细胞，发现转染成功的细胞均发绿色荧光；Western blot检测结果表明，所转染的BD‐NF在SGCs细胞中成功表达。【结论】成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和BDNF的真核表达质粒pTracer‐CMV／Bsd‐BDNF ，为进一步研究BDNF在内耳基因治疗中的作用奠定了基础。