【摘 要】
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以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)为模型体系,建立了非天然氨基酸代谢掺入法检测特定新生成蛋白的方
【机 构】
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吉林大学第二医院研究中心,吉林大学第一医院内分泌科,吉林大学中日联谊医院神经内科
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(No.81472030);吉林省科技厅项目(Nos.20110739,20180101267JC);吉林大学白求恩计划B(No.2012210);吉林省卫生和计划生育委员会项目(No.2015Z041)资助~~
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以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)为模型体系,建立了非天然氨基酸代谢掺入法检测特定新生成蛋白的方法。通过代谢掺入的方法,使细胞中的蛋白质,特别是新生成的蛋白质一级结构中掺入非天然氨基酸,即带有叠氮基团的甲硫氨酸类似物(Azidohomoalanine,AHA)。考察了在不同浓度的LPS和FBS,以及不同的刺激时间等条件下,LPS刺激Raw264.7细胞产生TNF-α的实验参数,确定了最优的实验条件为:在含有1%胎牛血清的无甲硫氨酸(Met)的DMEM培养基中,分别在不加LPS和加10 ng/m L的LPS条件下刺激Raw264.7细胞4 h,在刺激细胞的同时掺入AHA。利用Cu+催化的叠氮基团与带有生物素(Biotin)标签的炔烃基团的环加成反应,使蛋白质标记上Biotin标签。利用吸附在固相载体上的抗体特异性捕获TNF-α分子,再用耦联辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)的链霉亲和素(Streptavidin)对TNF-α分子上的Biotin进行识别,实现对特定的新生成蛋白质(TNF-α)进行检测。本方法为检测特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白质的周转等研究提供了新的思路法。
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