【摘 要】
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目的 以pGBKT7-CT813作为诱饵质粒与HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库进行酵母双杂交试验,以进一步探讨沙眼衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能. 方法 根据STD基因库提供信息设
【机 构】
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河北北方学院病原生物学实验室,河北张家口075000
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目的 以pGBKT7-CT813作为诱饵质粒与HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库进行酵母双杂交试验,以进一步探讨沙眼衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能. 方法 根据STD基因库提供信息设计引物,用PCR法获取目的基因片段CT813,经酶切处理的CT813和pGBKT7质粒,在T4连接酶作用下连接,连接产物转入感受态细胞BL21,培养后进行菌落PCR验证,对阳性质粒进行测序分析.质粒转化入酵母菌株Y187和AH109中,检测其有无自激活及毒性作用.阳性重组酵母菌株AH109与cDNA文库菌株Y187进行配合,待三叶草(或米奇)形状合子形成后涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培养基和铺有X-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上初筛,再经过2次筛选,收集阳性菌落.将阳性菌液点种在滤纸上,在液氮中反复冻融2次,然后浸泡在Z缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal混合液中室温温育8h.对筛选出的显色阳性菌液进行PCR验证.选取22个PCR阳性菌液提取酵母质粒,将22个质粒再转入感受态细胞E.coli,BL-21,对阳性菌落提取质粒,进行回交试验,对验证阳性的菌落对应的质粒进行测序. 结果 成功构建了pGBKT7-CT813诱饵质粒,该质粒的表达产物对AH109和Y187均无自激活和毒性作用.将回交试验筛选的阳性菌落对应的质粒进行测序,对测序结果做BLAST检索分析,确定筛选出与pGBKT7-CT813特异性相互作用的基因可能编码的蛋白是:半乳糖凝集素-1(LGALS1)、环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、核糖体核糖体蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16). 结论 筛选出的4种蛋白可能与沙眼衣原体的致病机制相关,但仍需要进一步验证.pGBKT7-CT813编码产物与多种蛋白有相互作用,为进一步研究其生物学功能打下了基础.
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