【摘 要】
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为了研究Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是否为猪肺炎支原体(Mycoplasmah yopneumoniae,Mhp)的毒力因子,并参与其致病作用,根据已发表的猪肺炎支原体醛缩酶全基因序列设计特异性
【机 构】
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江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京,210014南京农业大学,江苏南京,210014;
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为了研究Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是否为猪肺炎支原体(Mycoplasmah yopneumoniae,Mhp)的毒力因子,并参与其致病作用,根据已发表的猪肺炎支原体醛缩酶全基因序列设计特异性的引物,以猪肺炎支原体168株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增醛缩酶基因.将FBA克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析,结果表明,FBA基因全长864 bp.将构建的重组表达质粒pET-28a(+)/FBA转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),通过筛选获得阳性克隆,重组工程菌在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白猪肺炎支原体Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(Mhp FBA),大小约为35 ku.纯化蛋白并接种于猪气管上皮细胞至FBA终浓度分别为0、10、50、100、150、200 μg/mL,孵育24 h后进行上清中丙酮酸浓度的检测和细胞凋亡检测.结果 上清中丙酮酸浓度随着FBA浓度的上升,出现先极显著上升(P＜0.01)、后急剧下降的现象;细胞平均凋亡率依次分别为3.54％、10.91％、13.99％、27.19％、32.84％和40.71％,并随着FBA浓度的升高而升高,且相比阴性对照组差异均显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01).成功构建了Mhp FBA重组菌,表达获得了Mhp重组蛋白FBA,该蛋白可能为猪肺炎支原体的毒力因子,参与猪肺炎支原体的致病作用,从而为进一步开展Mhp致病机理和药物研究奠定基础.
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