论文部分内容阅读
摘要：为优化蝴蝶兰组培快繁及小苗温室移栽技术，研究以蝴蝶兰花梗段侧芽为外植体的高效快繁技术。在MS 3.0 mg/L 6-BA 1.0 g/L 花宝1号培养基中诱导出营养芽，2个月诱导率达90%；而用VW 3.0 mg/L 6-BA 1.0 g/L花宝1号 10%香蕉泥培养基诱导出花葶，2～3个月诱导率达80%。利用诱导的无菌营养芽、花葶节段切片在MS 5.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA 10%椰子汁 30 mg/L 柠檬酸培养基中，2个月诱导出丛生芽，再利用小块丛生芽分化增殖丛生芽，1.5个月增殖率可达6倍。当芽长超过1.5 cm时，在1/2MS 0.1 mg/L 6-BA 0.3 mg/L NAA 0.2%活性炭培养基中壮苗生根，2个月后小苗长出3条以上的根，根长超过1.5 cm，于智能温室炼苗3～4周后移栽。应用该小苗移栽试验方法，经统计3个月后成活率可达95%。
关键词：蝴蝶兰；花梗侧芽；营养芽；花葶；丛生芽
中图分类号： S682.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0083-04
收稿日期：2014-10-12
基金项目：河南省平顶山市农业科学院自选项目。
作者简介：张伟（1977—），男，陕西汉中人，助理研究员，主要从事现代农业生物技术组培的研究。E-mail：zhw9380@163.com。蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）别称蝶兰，被誉为“洋兰皇后”，是热带兰中的珍品[1]。蝴蝶兰花朵硕大、朵数多、开花期长、花色艳丽、色泽丰富，可盆栽放置于书房、客厅、卧室等处，典雅大方并给人以美的享受，花朵可作新娘的捧花、襟花、胸花，同时是切花的好材料[2]。蝴蝶兰是兰科植物中栽培最广泛、普及程度最高的品种之一，深受各国人民喜爱。蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株极少发育侧枝，且种子极难萌发，实生苗变异严重，不适于大规模商业种植。应用植物组培快繁技术可在短期内生产大量整齐一致的种苗，因此大规模商业种植一般采用组织培养快繁的方法[3]。关于蝴蝶兰组织培养的报道较多[4-7]，多以蝴蝶兰的叶片[8]、茎尖[8-9]、花梗腋芽[8-11]、种子[12]、根尖[8]、花梗节间[13]为外植体进行组织培养研究，而对以花梗为外植体的研究常采用未开花、即将开花的花梗，这对母株伤害较大，将影响其观赏价值、经济价值[14]。本试验于蝴蝶兰开花3个月后（农历正月之后）采摘花梗，尽量减少对其观赏价值、经济价值的影响。以蝴蝶兰丛生芽途径开展组培快繁，具有诱导率高、诱导时间短、丛生芽增殖率高（可达6倍）、技术难度低、遗传性能稳定等优点，可避免生产中发生大量变异，对大规模生产具有重要意义[15]。在前人研究的基础上，开发出一套成熟、先进的蝴蝶兰组培快繁及温室移栽技术，以期为相关生产及研究提供参考。
1材料与方法
1.1供试蝴蝶兰
供试蝴蝶兰采自河南省平顶山市农业科学院农业生物技术实验室智能温室，于2013年3月至5月初采取，品种为宝龙皇后。
1.2外植体
供试外植体为蝴蝶兰花梗节间侧芽，以及花梗段侧芽诱导出的无菌营养芽和花葶，以营养芽和花葶作为组培快繁试验材料。
1.3消毒过程
剪取蝴蝶兰母株近基部花梗，将花梗切割为2～3 cm长的切段，每个花梗切段带1个节间侧芽，每节距侧芽上部1 cm、下部2 cm。消毒时先用洗洁精与自来水清洗30 min，于超净工作台中用75%乙醇浸泡30 s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡13 min，倒掉HgCl2并用无菌水冲洗4～6遍。消毒后切去花梗段两端少许部分，按照正常生长方向将花梗节段插入供试培养基。
1.4供试培养基
基础培养基为MS、VW、1/2 MS。采用不同质量浓度植物生长调节剂的培养基进行诱导与增殖，并进行壮苗生根培养，培养环境为：温度（25±2） ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照时间12 h/d。筛选出5种主要培养基（20.0 g蔗糖、6.0 g琼脂粉、pH值5.6～5.8）。诱导培养基（A）：MS 30 mg/L 6-BA 1.0 g/L花宝1号 30 mg/L柠檬酸；诱导培养基（B）：VW 3.0 mg/L 6-BA 1.0 g/L花宝1号 100 g/L香蕉泥 30 mg/L柠檬酸 1.0 g/L活性炭；分化培养基（C）：MS 5.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA 10%椰子汁 30 mg/L 柠檬酸；壮苗生根培养基（D）：1/2MS 0.1 mg/L 6-BA 0.3 mg/L NAA 2.0 g/L活性炭。
1.5小苗炼苗和移栽
将准备移栽的试管苗不揭盖连瓶置于温室3～4周炼苗。移栽时用水苔作栽培基质，所有操作工具和水苔均消毒灭菌。移栽前先将水苔用清水浸泡12 h，甩干后方可使用。移栽时打开封口膜，小心夹出小苗，洗净根部培养基，于0.2%高锰酸钾溶液中浸泡几分钟后捞出，用甩干的水苔包住小苗根部，放入穴盘中；将移栽好的小苗穴盘放置于白天温度22～30 ℃、夜晚温度18～25 ℃、相对湿度65%～85%、光照度低于10 000 lx、洁净通风的环境中。移栽结束后用2 000倍多菌灵杀菌剂对小苗统一喷洒，2周1次，连续喷洒3次；第1周保持每天上午、下午2次喷雾增湿，第2周后浇水并且每1～2周施用1次均衡肥料，于3个月时统计。
2结果与分析
2.1技术路线
试验流程见图1、图2。
2.2花梗芽的诱导
利用花梗段侧芽在诱导培养基中诱导营养芽和花葶，培养2～3个月即可获得；培养过程中若培养基消耗过多或褐化严重则转接1次，培养基不变，连续3个月进行统计（表1）。由表1可见，MS、VW 2种基础培养基均可作为诱导培养基，但添加不同质量浓度的激素、添加物使2种基础培养基诱导出不同的植物组织；因此，不能表明某一培养基更适合作为诱导基础培养基。使用相同基础培养基，同时使用 6-BA、NAA时诱导率比单独使用6-BA时低，且萌动出芽时间长。当6-BA的浓度达到5.0 mg/L时，诱导率略下降且生长偏弱，表明此浓度或更高浓度并不适于蝴蝶兰花梗侧芽的诱导；单独使用3.0 mg/L浓度的6-BA时，蝴蝶兰花梗侧芽诱导率较好。本试验中A培养基（表1中2号培养基）外植体诱导表现突出，出芽最早且出芽率达到90 %，萌动仅需 12 d，形成营养芽需要2个月左右；VW培养基加入100 g/L香蕉泥、1.0 g/L花宝1号后，大多数诱导出花芽，其中B培养基（表1中5号培养基）的出芽率达到80 %，形成可诱导分化丛生芽的花葶需2～3个月。表1不同培养基对花梗侧芽诱导的结果 序号基础培养基激素浓度（mg/L）6-BANAA外植体数
（个）萌动出芽
时间（d）诱导率
（%）备注1MS1.00.1201835大部分为营养芽，出芽缓慢2MS3.00.0201290绝大部分为营养芽，生长健壮3MS5.0 0.5 201475大部分为营养芽，生长偏弱4VW1.00.3202030部分为花芽，生长较弱5VW3.00.0201580部分为花芽，出芽较快，生长健壮6VW5.00.0201770部分为花芽，生长偏弱注：所有培养基均添加1.0 g/L花宝1号、30 mg/L柠檬酸；VW诱导培养基均添加100 g/L香蕉泥。
2.3丛生芽的分化和增殖
将诱导出的营养芽从花梗节段基部切下，在各培养基中进行丛生芽分化增殖，于3个月时统计（表2）。由表2可见，营养芽分化增殖时MS培养基优于VW培养基。NAA浓度为0.5 mg/L、6-BA浓度为1.0～7.0 mg/L时营养芽分化的丛生芽增殖率逐渐提高；6-BA浓度为5.0 mg/L时诱导分化的平均出芽数较多，且生长健壮；6-BA浓度为7.0 mg/L时诱导分化的平均出芽数最多，但有部分畸形。可见，6-BA浓度过高并不能达到良好效果，只有6-BA、NAA在适宜浓度下配合使用，才能取得最好的营养芽分化增殖效果。C培养基（表2中Ⅱ号培养基）最适于营养芽分化再增殖，其分化出的芽数多、生长快、健壮、无畸形，且芽的生长均能成为小苗，最早1.5个月可见芽，但分化出增殖丛生芽需2个月左右；分化出丛生芽后采用多芽增殖并仍使用C培养基，可极大缩短增殖周期，仅需1.5个月。表2不同质量浓度6-BA培养基中营养出芽数（个）生长情况ⅠMS 1.00.530812.7增殖少，芽生长缓慢，长势不好ⅡMS5.00.5302167.2增殖多，芽生长快，健壮ⅢMS7.00.5302357.8增殖多，芽生长快，有畸形ⅣVW1.00.530571.9增殖少，芽生长缓慢，长势一般ⅤVW5.00.5301755.8增殖多，芽生长快，健壮ⅥVW7.00.5302016.7增殖多，芽生长快，有畸形注：培养基中均添加10%椰子汁、30 mg/L柠檬酸。
将花梗段侧芽诱导出的花葶节部横向切割为0.5～0.8 cm 的切片，按生长方向接入C培养基，约2个月可见小芽丛，分化增殖情况与营养芽增殖情况相似。
2.4小苗壮苗生根
当芽生长至1.5 cm时将其切下，转入D培养基中壮苗生根，约30 d可见生根，50 d长出3条以上根，2个月根长超过1.5 cm，则可进行炼苗。
2.5小苗移栽及栽培管理方法
小苗炼苗时，试管瓶不揭盖炼苗3～4周，移栽时挑选炼过苗的蝴蝶兰组培苗，要求其无污染、叶数3～5张、叶宽1.5～2.5 cm、叶子健壮、叶色翠绿、根数3条以上、根长0.8～3.0 cm、根系粗壮有活力、单轴茎较明显。小苗移栽后1周内不浇水，尽量以喷雾方式供给水分，以便小苗及早生根，同时可避免幼嫩小苗出现软腐病害，使小苗根部充分生长，但要保持较高的湿度；第2周即可浇水，当小苗水草表面干燥，且观察透明穴盘内下部无水滴水雾，即可浇透水；第3周后可施用液肥，施肥间隔期为1周1次，开始时采用较低肥料浓度，随后逐渐提高，但不可过高，小苗前期常施用N ∶P2O5 ∶K2O为 20% ∶20% ∶20% 的肥料，浓度为3 000～4 000倍液，施肥时应薄肥勤施。当小苗长出新叶、新根即为成活，3个月时的成活率可达95%以上。
3结论与讨论
蝴蝶兰一般通过有性繁殖、无性繁殖2种方式进行繁殖，有性繁殖多为杂交或自交苗，遗传性状不稳定，不能表现出优良的母本性状，且花色、花期不易控制，因此蝴蝶兰快繁通常采用无性繁殖[16]。蝴蝶兰植株极少发育侧枝，比其他种类兰花更难以进行常规无性繁殖，无法大量生产[17]，组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的主要手段[18-20]。在组织培养中，可通过诱导原球茎途径进行植株再生[21]，也可利用丛生芽途径快速繁殖，后者是从芽到芽的增殖，无需通过诱导原球茎分化不定芽来稳定遗传母本的特征特性，从而可降低后代发生变异的概率[22]。本试验采用从芽到芽的增殖途径，利用花梗芽诱导出的营养芽、花葶组织来诱导分化丛生芽，减少变异且分化时间短，大幅缩短了繁殖周期。
试验过程中第1次分化诱导使花梗段侧芽充分利用，不破坏母株并尽可能保存母体，达到商业种植的高效利用；丛生芽分化出来后的每次分化增殖过程均比第1次分化诱导过程缩短一半时间，1.5个月即可增殖6倍左右，其他资料中尚未见如此高的增殖倍数[16]。
由培养基的成分及外植体的培养过程可知，6-BA是诱导侧芽萌发的主要因子，这与谭文澄等的观点[19]一致。向VW培养基中添加香蕉泥、花宝1号可能是花梗侧芽诱导成花葶的主要因素，有待进一步研究证实。柠檬酸可有效抑制酶促褐变，通过降低褐变死亡率以提高诱导效率[23]，整个试验中向培养基添加30 mg/L柠檬酸效果显著，能够减少褐化。试验首次将营养芽、花葶节切片于相同培养基、相同环境下诱导分化出丛生芽；营养芽诱导分化丛生芽的关键点为茎基部，将营养芽底部和花梗节段接触的部分切割后培养才易诱导出丛生芽，丛生芽一般从营养芽基部的短缩茎分化出来，应注意保存该部位；将试管花葶节部上下切割为0.5～0.8 cm 的切片，注意保留节部，按自然生长方向放入培养基中才能诱导分化出大量节间丛生芽，没有节部的花葶组织一般无法分化出丛生芽。分化增殖培养基中的椰子汁同样是增殖的关键因素之一，从生产角度考虑，椰子汁含量为10%时增殖倍数、增殖时间、经济效益均为最佳。进行壮苗生根时，一般培养基只使用NAA或IBA进行生根，而本试验添加少量6-BA可使小苗健壮生长并生根，提前进入炼苗阶段。小苗移栽时，用02%高锰酸钾溶液浸泡小苗几分钟，既能杀菌消毒，又可使小苗伤口快速氧化愈合，从而提高成活率，此结论经实践总结得出。组培苗于春季移栽，若栽培管理得当第2年春节即可开花。 参考文献：
[1]范燕萍，邝禹洲，钟志权. 迎春花卉[M]. 广州：广东科技出版社，2003：45.
[2]王明启，彭立新. 家庭养花全书[M]. 沈阳：辽宁科学技术出版社，2004：235-236.
[3]曹孜义，刘国民. 实用植物组织培养技术教程[M]. 兰州：甘肃科学技术出版社，2002：179-181.
[4]王平，吴海红，赵兴华，等. 蝴蝶兰组织培养培养基组成的初步研究[J]. 沈阳农业大学学报，2004，35（1）：10-12.
[5]Liu T H，Lin J J，Wu R Y. The effects of using trehalose as a carbon source on the proliferation of Phalaen opsis and Doritaenopsis protocormr-likebodies[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，86：125-129.
[6]李军，柴向华，曾宝珰，等. 蝴蝶兰组培工厂化生产技术[J]. 园艺学报，2004，31（3）：413-414.
[7]Murdad R，Hwa K S，Seng C K，et al. High frequency multiplication of Phalaenopsis gigantea using trimmed bases protocorms technique[J]. Scientia Horticulturae，2006，111（1）：73-79.
[8]李娜. 蝴蝶兰的组织培养技术研究[J]. 江西农业学报，2008，20（9）：51-53.
[9]张伟，曾伏虎，张苏锋. 蝴蝶兰的组织培养与快速繁殖[J]. 信阳师范学院学报：自然科学版，2004，17（3）：335-337.
[10]顾东亚，蒋素华，崔 波，等. 蝴蝶兰组培快繁技术研究[J]. 北方园艺，2009（10）：196-198.
[11]刘亮，易自力，蒋建雄，等. 蝴蝶兰丛生芽、原球茎途径的组织培养研究[J]. 亚热带植物科学，2008，37（3）：43-45.
[12]Chen J T，Chang W C. Induction of repetitive embryo-genesis from seed-derived protocorms of Phalaenopsis amabilis var.formosa Shimadzu[J]. In Vitro Cellular
关键词：蝴蝶兰；花梗侧芽；营养芽；花葶；丛生芽
中图分类号： S682.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0083-04
收稿日期：2014-10-12
基金项目：河南省平顶山市农业科学院自选项目。
作者简介：张伟（1977—），男，陕西汉中人，助理研究员，主要从事现代农业生物技术组培的研究。E-mail：zhw9380@163.com。蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）别称蝶兰，被誉为“洋兰皇后”，是热带兰中的珍品[1]。蝴蝶兰花朵硕大、朵数多、开花期长、花色艳丽、色泽丰富，可盆栽放置于书房、客厅、卧室等处，典雅大方并给人以美的享受，花朵可作新娘的捧花、襟花、胸花，同时是切花的好材料[2]。蝴蝶兰是兰科植物中栽培最广泛、普及程度最高的品种之一，深受各国人民喜爱。蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株极少发育侧枝，且种子极难萌发，实生苗变异严重，不适于大规模商业种植。应用植物组培快繁技术可在短期内生产大量整齐一致的种苗，因此大规模商业种植一般采用组织培养快繁的方法[3]。关于蝴蝶兰组织培养的报道较多[4-7]，多以蝴蝶兰的叶片[8]、茎尖[8-9]、花梗腋芽[8-11]、种子[12]、根尖[8]、花梗节间[13]为外植体进行组织培养研究，而对以花梗为外植体的研究常采用未开花、即将开花的花梗，这对母株伤害较大，将影响其观赏价值、经济价值[14]。本试验于蝴蝶兰开花3个月后（农历正月之后）采摘花梗，尽量减少对其观赏价值、经济价值的影响。以蝴蝶兰丛生芽途径开展组培快繁，具有诱导率高、诱导时间短、丛生芽增殖率高（可达6倍）、技术难度低、遗传性能稳定等优点，可避免生产中发生大量变异，对大规模生产具有重要意义[15]。在前人研究的基础上，开发出一套成熟、先进的蝴蝶兰组培快繁及温室移栽技术，以期为相关生产及研究提供参考。
1材料与方法
1.1供试蝴蝶兰
供试蝴蝶兰采自河南省平顶山市农业科学院农业生物技术实验室智能温室，于2013年3月至5月初采取，品种为宝龙皇后。
1.2外植体
供试外植体为蝴蝶兰花梗节间侧芽，以及花梗段侧芽诱导出的无菌营养芽和花葶，以营养芽和花葶作为组培快繁试验材料。
1.3消毒过程
剪取蝴蝶兰母株近基部花梗，将花梗切割为2～3 cm长的切段，每个花梗切段带1个节间侧芽，每节距侧芽上部1 cm、下部2 cm。消毒时先用洗洁精与自来水清洗30 min，于超净工作台中用75%乙醇浸泡30 s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡13 min，倒掉HgCl2并用无菌水冲洗4～6遍。消毒后切去花梗段两端少许部分，按照正常生长方向将花梗节段插入供试培养基。
1.4供试培养基
基础培养基为MS、VW、1/2 MS。采用不同质量浓度植物生长调节剂的培养基进行诱导与增殖，并进行壮苗生根培养，培养环境为：温度（25±2） ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照时间12 h/d。筛选出5种主要培养基（20.0 g蔗糖、6.0 g琼脂粉、pH值5.6～5.8）。诱导培养基（A）：MS 30 mg/L 6-BA 1.0 g/L花宝1号 30 mg/L柠檬酸；诱导培养基（B）：VW 3.0 mg/L 6-BA 1.0 g/L花宝1号 100 g/L香蕉泥 30 mg/L柠檬酸 1.0 g/L活性炭；分化培养基（C）：MS 5.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA 10%椰子汁 30 mg/L 柠檬酸；壮苗生根培养基（D）：1/2MS 0.1 mg/L 6-BA 0.3 mg/L NAA 2.0 g/L活性炭。
1.5小苗炼苗和移栽
将准备移栽的试管苗不揭盖连瓶置于温室3～4周炼苗。移栽时用水苔作栽培基质，所有操作工具和水苔均消毒灭菌。移栽前先将水苔用清水浸泡12 h，甩干后方可使用。移栽时打开封口膜，小心夹出小苗，洗净根部培养基，于0.2%高锰酸钾溶液中浸泡几分钟后捞出，用甩干的水苔包住小苗根部，放入穴盘中；将移栽好的小苗穴盘放置于白天温度22～30 ℃、夜晚温度18～25 ℃、相对湿度65%～85%、光照度低于10 000 lx、洁净通风的环境中。移栽结束后用2 000倍多菌灵杀菌剂对小苗统一喷洒，2周1次，连续喷洒3次；第1周保持每天上午、下午2次喷雾增湿，第2周后浇水并且每1～2周施用1次均衡肥料，于3个月时统计。
2结果与分析
2.1技术路线
试验流程见图1、图2。
2.2花梗芽的诱导
利用花梗段侧芽在诱导培养基中诱导营养芽和花葶，培养2～3个月即可获得；培养过程中若培养基消耗过多或褐化严重则转接1次，培养基不变，连续3个月进行统计（表1）。由表1可见，MS、VW 2种基础培养基均可作为诱导培养基，但添加不同质量浓度的激素、添加物使2种基础培养基诱导出不同的植物组织；因此，不能表明某一培养基更适合作为诱导基础培养基。使用相同基础培养基，同时使用 6-BA、NAA时诱导率比单独使用6-BA时低，且萌动出芽时间长。当6-BA的浓度达到5.0 mg/L时，诱导率略下降且生长偏弱，表明此浓度或更高浓度并不适于蝴蝶兰花梗侧芽的诱导；单独使用3.0 mg/L浓度的6-BA时，蝴蝶兰花梗侧芽诱导率较好。本试验中A培养基（表1中2号培养基）外植体诱导表现突出，出芽最早且出芽率达到90 %，萌动仅需 12 d，形成营养芽需要2个月左右；VW培养基加入100 g/L香蕉泥、1.0 g/L花宝1号后，大多数诱导出花芽，其中B培养基（表1中5号培养基）的出芽率达到80 %，形成可诱导分化丛生芽的花葶需2～3个月。表1不同培养基对花梗侧芽诱导的结果 序号基础培养基激素浓度（mg/L）6-BANAA外植体数
（个）萌动出芽
时间（d）诱导率
（%）备注1MS1.00.1201835大部分为营养芽，出芽缓慢2MS3.00.0201290绝大部分为营养芽，生长健壮3MS5.0 0.5 201475大部分为营养芽，生长偏弱4VW1.00.3202030部分为花芽，生长较弱5VW3.00.0201580部分为花芽，出芽较快，生长健壮6VW5.00.0201770部分为花芽，生长偏弱注：所有培养基均添加1.0 g/L花宝1号、30 mg/L柠檬酸；VW诱导培养基均添加100 g/L香蕉泥。
2.3丛生芽的分化和增殖
将诱导出的营养芽从花梗节段基部切下，在各培养基中进行丛生芽分化增殖，于3个月时统计（表2）。由表2可见，营养芽分化增殖时MS培养基优于VW培养基。NAA浓度为0.5 mg/L、6-BA浓度为1.0～7.0 mg/L时营养芽分化的丛生芽增殖率逐渐提高；6-BA浓度为5.0 mg/L时诱导分化的平均出芽数较多，且生长健壮；6-BA浓度为7.0 mg/L时诱导分化的平均出芽数最多，但有部分畸形。可见，6-BA浓度过高并不能达到良好效果，只有6-BA、NAA在适宜浓度下配合使用，才能取得最好的营养芽分化增殖效果。C培养基（表2中Ⅱ号培养基）最适于营养芽分化再增殖，其分化出的芽数多、生长快、健壮、无畸形，且芽的生长均能成为小苗，最早1.5个月可见芽，但分化出增殖丛生芽需2个月左右；分化出丛生芽后采用多芽增殖并仍使用C培养基，可极大缩短增殖周期，仅需1.5个月。表2不同质量浓度6-BA培养基中营养出芽数（个）生长情况ⅠMS 1.00.530812.7增殖少，芽生长缓慢，长势不好ⅡMS5.00.5302167.2增殖多，芽生长快，健壮ⅢMS7.00.5302357.8增殖多，芽生长快，有畸形ⅣVW1.00.530571.9增殖少，芽生长缓慢，长势一般ⅤVW5.00.5301755.8增殖多，芽生长快，健壮ⅥVW7.00.5302016.7增殖多，芽生长快，有畸形注：培养基中均添加10%椰子汁、30 mg/L柠檬酸。
将花梗段侧芽诱导出的花葶节部横向切割为0.5～0.8 cm 的切片，按生长方向接入C培养基，约2个月可见小芽丛，分化增殖情况与营养芽增殖情况相似。
2.4小苗壮苗生根
当芽生长至1.5 cm时将其切下，转入D培养基中壮苗生根，约30 d可见生根，50 d长出3条以上根，2个月根长超过1.5 cm，则可进行炼苗。
2.5小苗移栽及栽培管理方法
小苗炼苗时，试管瓶不揭盖炼苗3～4周，移栽时挑选炼过苗的蝴蝶兰组培苗，要求其无污染、叶数3～5张、叶宽1.5～2.5 cm、叶子健壮、叶色翠绿、根数3条以上、根长0.8～3.0 cm、根系粗壮有活力、单轴茎较明显。小苗移栽后1周内不浇水，尽量以喷雾方式供给水分，以便小苗及早生根，同时可避免幼嫩小苗出现软腐病害，使小苗根部充分生长，但要保持较高的湿度；第2周即可浇水，当小苗水草表面干燥，且观察透明穴盘内下部无水滴水雾，即可浇透水；第3周后可施用液肥，施肥间隔期为1周1次，开始时采用较低肥料浓度，随后逐渐提高，但不可过高，小苗前期常施用N ∶P2O5 ∶K2O为 20% ∶20% ∶20% 的肥料，浓度为3 000～4 000倍液，施肥时应薄肥勤施。当小苗长出新叶、新根即为成活，3个月时的成活率可达95%以上。
3结论与讨论
蝴蝶兰一般通过有性繁殖、无性繁殖2种方式进行繁殖，有性繁殖多为杂交或自交苗，遗传性状不稳定，不能表现出优良的母本性状，且花色、花期不易控制，因此蝴蝶兰快繁通常采用无性繁殖[16]。蝴蝶兰植株极少发育侧枝，比其他种类兰花更难以进行常规无性繁殖，无法大量生产[17]，组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的主要手段[18-20]。在组织培养中，可通过诱导原球茎途径进行植株再生[21]，也可利用丛生芽途径快速繁殖，后者是从芽到芽的增殖，无需通过诱导原球茎分化不定芽来稳定遗传母本的特征特性，从而可降低后代发生变异的概率[22]。本试验采用从芽到芽的增殖途径，利用花梗芽诱导出的营养芽、花葶组织来诱导分化丛生芽，减少变异且分化时间短，大幅缩短了繁殖周期。
试验过程中第1次分化诱导使花梗段侧芽充分利用，不破坏母株并尽可能保存母体，达到商业种植的高效利用；丛生芽分化出来后的每次分化增殖过程均比第1次分化诱导过程缩短一半时间，1.5个月即可增殖6倍左右，其他资料中尚未见如此高的增殖倍数[16]。
由培养基的成分及外植体的培养过程可知，6-BA是诱导侧芽萌发的主要因子，这与谭文澄等的观点[19]一致。向VW培养基中添加香蕉泥、花宝1号可能是花梗侧芽诱导成花葶的主要因素，有待进一步研究证实。柠檬酸可有效抑制酶促褐变，通过降低褐变死亡率以提高诱导效率[23]，整个试验中向培养基添加30 mg/L柠檬酸效果显著，能够减少褐化。试验首次将营养芽、花葶节切片于相同培养基、相同环境下诱导分化出丛生芽；营养芽诱导分化丛生芽的关键点为茎基部，将营养芽底部和花梗节段接触的部分切割后培养才易诱导出丛生芽，丛生芽一般从营养芽基部的短缩茎分化出来，应注意保存该部位；将试管花葶节部上下切割为0.5～0.8 cm 的切片，注意保留节部，按自然生长方向放入培养基中才能诱导分化出大量节间丛生芽，没有节部的花葶组织一般无法分化出丛生芽。分化增殖培养基中的椰子汁同样是增殖的关键因素之一，从生产角度考虑，椰子汁含量为10%时增殖倍数、增殖时间、经济效益均为最佳。进行壮苗生根时，一般培养基只使用NAA或IBA进行生根，而本试验添加少量6-BA可使小苗健壮生长并生根，提前进入炼苗阶段。小苗移栽时，用02%高锰酸钾溶液浸泡小苗几分钟，既能杀菌消毒，又可使小苗伤口快速氧化愈合，从而提高成活率，此结论经实践总结得出。组培苗于春季移栽，若栽培管理得当第2年春节即可开花。 参考文献：
[1]范燕萍，邝禹洲，钟志权. 迎春花卉[M]. 广州：广东科技出版社，2003：45.
[2]王明启，彭立新. 家庭养花全书[M]. 沈阳：辽宁科学技术出版社，2004：235-236.
[3]曹孜义，刘国民. 实用植物组织培养技术教程[M]. 兰州：甘肃科学技术出版社，2002：179-181.
[4]王平，吴海红，赵兴华，等. 蝴蝶兰组织培养培养基组成的初步研究[J]. 沈阳农业大学学报，2004，35（1）：10-12.
[5]Liu T H，Lin J J，Wu R Y. The effects of using trehalose as a carbon source on the proliferation of Phalaen opsis and Doritaenopsis protocormr-likebodies[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，86：125-129.
[6]李军，柴向华，曾宝珰，等. 蝴蝶兰组培工厂化生产技术[J]. 园艺学报，2004，31（3）：413-414.
[7]Murdad R，Hwa K S，Seng C K，et al. High frequency multiplication of Phalaenopsis gigantea using trimmed bases protocorms technique[J]. Scientia Horticulturae，2006，111（1）：73-79.
[8]李娜. 蝴蝶兰的组织培养技术研究[J]. 江西农业学报，2008，20（9）：51-53.
[9]张伟，曾伏虎，张苏锋. 蝴蝶兰的组织培养与快速繁殖[J]. 信阳师范学院学报：自然科学版，2004，17（3）：335-337.
[10]顾东亚，蒋素华，崔 波，等. 蝴蝶兰组培快繁技术研究[J]. 北方园艺，2009（10）：196-198.
[11]刘亮，易自力，蒋建雄，等. 蝴蝶兰丛生芽、原球茎途径的组织培养研究[J]. 亚热带植物科学，2008，37（3）：43-45.
[12]Chen J T，Chang W C. Induction of repetitive embryo-genesis from seed-derived protocorms of Phalaenopsis amabilis var.formosa Shimadzu[J]. In Vitro Cellular