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摘要 以2014年收获的5个粳稻品种和2013年收获的5个粳稻品种为试验材料，设置3个浓度的红墨水溶液和3个浓度的TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液，对10份试验材料分别浸种4.5、12.0、24.0 h，测定种子的生活力，并与实际发芽率进行比较。研究表明：5.0%红墨水溶液和0.10% TTC溶液测定的种子生活力与发芽率结果相关系数更高，TTC染色法比红墨水染色法测定结果更准确。不同浸种时间对这2种快速测定种子活力的方法影响不明显，综合考虑以0.10% TTC和5.0%红墨水浸种12 h为佳，可以准确预测水稻发芽率。
关键词 水稻；种子活力；红墨水染色法；TTC染色法；浓度
中图分类号 S330.3 1；S511 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0029-02
种子发芽率是衡量种子质量和实用价值的重要指标，是种子质量检验的主要内容，同时又是种子分级和定价的重要凭据。在水稻种子的生产、收购、贮藏运输及销售中需及时了解其发芽率，以确定能否作为播种材料或销售材料，而用常规方法测定的发芽率，时间较长。目前，关于红墨水染色法测定花生、麦、玉米、腰果、大豆等种子发芽率报道和TTC染色法作为种子生活力的鉴定标准已被广泛应用[1-7]。
种子的胚细胞只要具有活力，其原生质膜就具有选择透性，能选择性吸收物质。像苯胺类染料（如红墨水）不能进入活细胞内，胚部不被染色；而丧失活力的种子，它的胚细胞原生质膜没有选择吸收能力，染料就能自由进入死细胞内染色。因此，可根据种子胚部染色情况判断种子是否具有活力。
具有生命活力的种子胚的细胞内有脱氢辅酶（NADH2或NADPH2），而且只要是有生命活力的种子胚，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而没有生命活力的种子胚没有此反应，当TTC无色溶液深入种子胚的活细胞时，接受活种子呼吸过程中脱氢辅酶产生的氢，被脱氢酶还原成不溶于水的红色稳定不扩散的TTF（三苯基甲酯）。
试验设置不同浓度的红墨水溶液和不同浓度的TTC溶液进行不同时间浸种，使水稻种子染色，鉴定种子的生活力，并将结果与常规方法所测发芽率进行比较，估测水稻种子发芽率，探讨出测定水稻种子发芽率准确、快速、方便的检测方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试水稻品种共10个，其中2014年收获的品种5个：垦育118、垦育88、丰粳1、粳优558和洼粳1；2013年收获的品种5个：垦育118（以下表示为垦育118-）、垦育88（以下表示为垦育88-）、垦育16（以下表示为垦育16-）、垦育40（以下表示为垦育40-）和垦育60（以下表示为垦育60-）。
试验用具：恒温箱、培养皿、滤纸、量筒、烧杯、刀片、镊子、蒸馏水等。
1.2 试验方法
1.2.1 常规方法。每个品种设3次重复，每个重复随机取种子100粒，将种子放在经过消毒的培养皿中，培养皿内已经铺好滤纸，在培养皿中加水，保持湿润。然后放在30 ℃左右恒温培养箱中，5 d后初次计数（发芽势），末次在10～14 d统计发芽率（胚根露出种皮3 mm视为发芽）。
1.2.2 红墨水染色法。配制2.5%、5.0%、7.5%的红墨水溶液；每个品种分别浸种4.5、12.0、24.0 h，3次重复。剥去种皮，用刀片沿腹沟纵切两半（测定的一半一定要带胚），取100粒待测定带胚的种子放入培养皿中，进行编号。分别加入2.5%、5.0%、7.5%红墨水，以覆盖种子为度，染色10～15 min，取出洗净，直到洗液无色为止。凡是胚部完全没有染色或胚根尖端着色部分小于种胚全长的1/3，都具有生活力。但如果种胚与胚乳着色程度相同或子叶着色、胚根着色部分大于种胚全长的1/3或胚茎着色，即为无活力种子[8]。
1.2.3 TTC染色法（氯化三苯基四氮唑染色法）。配制0.05%、0.10%、0.50% TTC溶液，避光保存，溶液一旦变成红色不能再用。样品处理与红墨水染色法相同。每个培养皿中分别加入0.05%、0.10%、0.50% TTC溶液，然后将其放在30 ℃左右的恒温箱中1.5 h左右，随后将TTC溶液倒掉，并用水反复冲洗几次，观察染色情况。胚部呈红色的则具有生活力，呈浅红色的具有较弱的生活力，无色的便是无活力种子。但发芽试验发现呈浅红色的一般也可发芽，所以呈浅红色的也算具有发芽能力。
1.3 数据处理公式
2 结果与分析
2.1 水稻种子活力与发芽率相关性
根据相关系数公式，测定水稻种子活力与实际发芽率相关系数如表1所示。可以看出，测定生活力与实际发芽率的相关系数在0.61～0.95之间，平均为0.80。除浸种4.5 h 7.5%红墨水测定发芽率相关系数未达到显著水平外，其余处理相关系数均达显著或极显著水平。由此表明，以5.0%红墨水和0.10% TTC处理效果最好。浸种时间：红墨水12～24 h均可，TTC 4.5～24.0 h均可，实际操作中，浸种4.5 h，种子较硬，刀片切割困难，综合考虑以浸种12 h为宜。
2.2 方差分析
根据相关系数计算结果，进行方差分析，结果如表2所示。可以看出，不同浸种时间下测定的种子活力相关系数没有显著差异。不同处理之间测定种子活力相关系数差异达到极显著水平。其中0.10% TTC相关系数平均值最高，达到0.94。
2.3 TTC法和红墨水法的比较
由表1可知，红墨水法处理的相关系数平均为0.76，TTC法处理的相关系数平均值为0.84。经t检验，差异达到极显著水平。TTC法测定种子活力相关系数高于红墨水法测定种子活力相关系数。0.10% TTC处理较5.0%红墨水处理判定水稻种子活力更准确。 2.4 不同浓度的红墨水测定种子生活力比较
由表1可知，2.5%红墨水相关系数的平均值为0.77， 5.0%红墨水相关系数的平均值为0.85，7.5%红墨水相关系数的平均值为0.65。由此可见，5.0%红墨水所测定的种子活力更接近实际发芽率。
2.5 不同浓度TTC测定种子生活力比较
由表1可知，0.05%TTC相关系数的平均值为0.81， 0.10% TTC相关系数的平均值为0.94，0.50% TTC相关系数的平均值为0.77。由此可见，0.10% TTC所测定的种子活力更接近实际发芽率。
2.6 依据回归方程测定实际发芽率
将5.0%红墨水和0.10% TTC所测活力率分别与实际发芽率进行t检验，差异不显著。根据5.0%红墨水测定种子活力与实际发芽率，得到预测方程为y=1.127 4x-0.081 1，R2=0.774 1（图1）。根据上述方程，采用红墨水法测定种子生活力来估测发芽率（表3）。
根据0.10% TTC测定种子活力与实际发芽率，得到预测方程为y=0.910 6x 0.101 9，R2=0.901 9（图2）。根据上述方程，采用四唑法测定种子生活力来估测发芽率（表3）。
R2越接近1，y随x的预测值越准确。而0.10% TTC法所测得的R2比5.0%红墨水法测得的R2高，说明0.10% TTC比5.0%红墨水法预测更准确。
3 结论与讨论
（1）红墨水染色法和TTC染色法均可以快速测定种子活力，并准确地估测出水稻种子发芽率，是快速测定水稻种子发芽率简单可行的好方法。
（2）5.0%红墨水溶液和0.10% TTC溶液所测结果更接近实际发芽率。虽然红墨水法不需要特殊试剂，操作简单，但测定结果没有TTC法准确，而且在区分染色与被染色数目时不如TTC法容易观察。
（3）除了7.5%红墨水浸种4.5 h外，不同浸种时间下测定的种子活力没有显著差异，但是浸种时间为4.5 h的种子，不能充分地吸收水分，且在切种子时不容易操作，容易将种子切碎。因此，在时间允许的情况下，在以种子浸泡12 h为宜。
（4）水稻实际发芽率与红墨水法和TTC法测定生活力的回归方程分别为y=1.127 4x-0.081 1、y=0.910 6x 0.101 9，因此可以将红墨水法和TTC法测定水稻的生活力值代入回归方程，预测水稻种子实际发芽率。
（5）红墨水和TTC测定法方便、快速、操作简单、成本低廉，但其只用来预测种子的潜在生活力，并不能完全取代实际发芽率试验，尤其对于法定检验机构来说更应以实际检验结果为凭据。
4 参考文献
[1] 李双铃，袁美，任艳，等.花生种子发芽率快速测定法[J].花生学报，2005，33（4）：30-32.
[2] 张振宗.大麦种子发芽率的快速测定方法——红墨水染色法[J].大麦科学，1995（3）：39.
[3] 秦家顺.改进的种子生活力快速测定法[J].植物生理学通讯，1998，34（1）：52-54.
[4] 宋志刚，赵曙国，郭成亮，等.玉米发芽率快速检测方法的研究[J].检验检疫科学，2003，13（4）：39-41.
[5] 刘汝符，郑秀珍.红墨水染色法 麦种发芽力鉴定[J].农业科技通讯，1980（8）：1.
[6] 洪彩香.腰果种子发芽率的快速测定方法[J].热带农业科学，2004，23（4）：5-9.
[7] 沈增学，张阿三.红墨水速测桑籽发芽率[J].江苏蚕业，1977（3）：17.
[8] 盛海平，汪为民.水稻种子生活力四唑测定值与发芽率间的相关性[J].种子，2000（2）：30-31.
关键词 水稻；种子活力；红墨水染色法；TTC染色法；浓度
中图分类号 S330.3 1；S511 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）08-0029-02
种子发芽率是衡量种子质量和实用价值的重要指标，是种子质量检验的主要内容，同时又是种子分级和定价的重要凭据。在水稻种子的生产、收购、贮藏运输及销售中需及时了解其发芽率，以确定能否作为播种材料或销售材料，而用常规方法测定的发芽率，时间较长。目前，关于红墨水染色法测定花生、麦、玉米、腰果、大豆等种子发芽率报道和TTC染色法作为种子生活力的鉴定标准已被广泛应用[1-7]。
种子的胚细胞只要具有活力，其原生质膜就具有选择透性，能选择性吸收物质。像苯胺类染料（如红墨水）不能进入活细胞内，胚部不被染色；而丧失活力的种子，它的胚细胞原生质膜没有选择吸收能力，染料就能自由进入死细胞内染色。因此，可根据种子胚部染色情况判断种子是否具有活力。
具有生命活力的种子胚的细胞内有脱氢辅酶（NADH2或NADPH2），而且只要是有生命活力的种子胚，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而没有生命活力的种子胚没有此反应，当TTC无色溶液深入种子胚的活细胞时，接受活种子呼吸过程中脱氢辅酶产生的氢，被脱氢酶还原成不溶于水的红色稳定不扩散的TTF（三苯基甲酯）。
试验设置不同浓度的红墨水溶液和不同浓度的TTC溶液进行不同时间浸种，使水稻种子染色，鉴定种子的生活力，并将结果与常规方法所测发芽率进行比较，估测水稻种子发芽率，探讨出测定水稻种子发芽率准确、快速、方便的检测方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试水稻品种共10个，其中2014年收获的品种5个：垦育118、垦育88、丰粳1、粳优558和洼粳1；2013年收获的品种5个：垦育118（以下表示为垦育118-）、垦育88（以下表示为垦育88-）、垦育16（以下表示为垦育16-）、垦育40（以下表示为垦育40-）和垦育60（以下表示为垦育60-）。
试验用具：恒温箱、培养皿、滤纸、量筒、烧杯、刀片、镊子、蒸馏水等。
1.2 试验方法
1.2.1 常规方法。每个品种设3次重复，每个重复随机取种子100粒，将种子放在经过消毒的培养皿中，培养皿内已经铺好滤纸，在培养皿中加水，保持湿润。然后放在30 ℃左右恒温培养箱中，5 d后初次计数（发芽势），末次在10～14 d统计发芽率（胚根露出种皮3 mm视为发芽）。
1.2.2 红墨水染色法。配制2.5%、5.0%、7.5%的红墨水溶液；每个品种分别浸种4.5、12.0、24.0 h，3次重复。剥去种皮，用刀片沿腹沟纵切两半（测定的一半一定要带胚），取100粒待测定带胚的种子放入培养皿中，进行编号。分别加入2.5%、5.0%、7.5%红墨水，以覆盖种子为度，染色10～15 min，取出洗净，直到洗液无色为止。凡是胚部完全没有染色或胚根尖端着色部分小于种胚全长的1/3，都具有生活力。但如果种胚与胚乳着色程度相同或子叶着色、胚根着色部分大于种胚全长的1/3或胚茎着色，即为无活力种子[8]。
1.2.3 TTC染色法（氯化三苯基四氮唑染色法）。配制0.05%、0.10%、0.50% TTC溶液，避光保存，溶液一旦变成红色不能再用。样品处理与红墨水染色法相同。每个培养皿中分别加入0.05%、0.10%、0.50% TTC溶液，然后将其放在30 ℃左右的恒温箱中1.5 h左右，随后将TTC溶液倒掉，并用水反复冲洗几次，观察染色情况。胚部呈红色的则具有生活力，呈浅红色的具有较弱的生活力，无色的便是无活力种子。但发芽试验发现呈浅红色的一般也可发芽，所以呈浅红色的也算具有发芽能力。
1.3 数据处理公式
2 结果与分析
2.1 水稻种子活力与发芽率相关性
根据相关系数公式，测定水稻种子活力与实际发芽率相关系数如表1所示。可以看出，测定生活力与实际发芽率的相关系数在0.61～0.95之间，平均为0.80。除浸种4.5 h 7.5%红墨水测定发芽率相关系数未达到显著水平外，其余处理相关系数均达显著或极显著水平。由此表明，以5.0%红墨水和0.10% TTC处理效果最好。浸种时间：红墨水12～24 h均可，TTC 4.5～24.0 h均可，实际操作中，浸种4.5 h，种子较硬，刀片切割困难，综合考虑以浸种12 h为宜。
2.2 方差分析
根据相关系数计算结果，进行方差分析，结果如表2所示。可以看出，不同浸种时间下测定的种子活力相关系数没有显著差异。不同处理之间测定种子活力相关系数差异达到极显著水平。其中0.10% TTC相关系数平均值最高，达到0.94。
2.3 TTC法和红墨水法的比较
由表1可知，红墨水法处理的相关系数平均为0.76，TTC法处理的相关系数平均值为0.84。经t检验，差异达到极显著水平。TTC法测定种子活力相关系数高于红墨水法测定种子活力相关系数。0.10% TTC处理较5.0%红墨水处理判定水稻种子活力更准确。 2.4 不同浓度的红墨水测定种子生活力比较
由表1可知，2.5%红墨水相关系数的平均值为0.77， 5.0%红墨水相关系数的平均值为0.85，7.5%红墨水相关系数的平均值为0.65。由此可见，5.0%红墨水所测定的种子活力更接近实际发芽率。
2.5 不同浓度TTC测定种子生活力比较
由表1可知，0.05%TTC相关系数的平均值为0.81， 0.10% TTC相关系数的平均值为0.94，0.50% TTC相关系数的平均值为0.77。由此可见，0.10% TTC所测定的种子活力更接近实际发芽率。
2.6 依据回归方程测定实际发芽率
将5.0%红墨水和0.10% TTC所测活力率分别与实际发芽率进行t检验，差异不显著。根据5.0%红墨水测定种子活力与实际发芽率，得到预测方程为y=1.127 4x-0.081 1，R2=0.774 1（图1）。根据上述方程，采用红墨水法测定种子生活力来估测发芽率（表3）。
根据0.10% TTC测定种子活力与实际发芽率，得到预测方程为y=0.910 6x 0.101 9，R2=0.901 9（图2）。根据上述方程，采用四唑法测定种子生活力来估测发芽率（表3）。
R2越接近1，y随x的预测值越准确。而0.10% TTC法所测得的R2比5.0%红墨水法测得的R2高，说明0.10% TTC比5.0%红墨水法预测更准确。
3 结论与讨论
（1）红墨水染色法和TTC染色法均可以快速测定种子活力，并准确地估测出水稻种子发芽率，是快速测定水稻种子发芽率简单可行的好方法。
（2）5.0%红墨水溶液和0.10% TTC溶液所测结果更接近实际发芽率。虽然红墨水法不需要特殊试剂，操作简单，但测定结果没有TTC法准确，而且在区分染色与被染色数目时不如TTC法容易观察。
（3）除了7.5%红墨水浸种4.5 h外，不同浸种时间下测定的种子活力没有显著差异，但是浸种时间为4.5 h的种子，不能充分地吸收水分，且在切种子时不容易操作，容易将种子切碎。因此，在时间允许的情况下，在以种子浸泡12 h为宜。
（4）水稻实际发芽率与红墨水法和TTC法测定生活力的回归方程分别为y=1.127 4x-0.081 1、y=0.910 6x 0.101 9，因此可以将红墨水法和TTC法测定水稻的生活力值代入回归方程，预测水稻种子实际发芽率。
（5）红墨水和TTC测定法方便、快速、操作简单、成本低廉，但其只用来预测种子的潜在生活力，并不能完全取代实际发芽率试验，尤其对于法定检验机构来说更应以实际检验结果为凭据。
4 参考文献
[1] 李双铃，袁美，任艳，等.花生种子发芽率快速测定法[J].花生学报，2005，33（4）：30-32.
[2] 张振宗.大麦种子发芽率的快速测定方法——红墨水染色法[J].大麦科学，1995（3）：39.
[3] 秦家顺.改进的种子生活力快速测定法[J].植物生理学通讯，1998，34（1）：52-54.
[4] 宋志刚，赵曙国，郭成亮，等.玉米发芽率快速检测方法的研究[J].检验检疫科学，2003，13（4）：39-41.
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[7] 沈增学，张阿三.红墨水速测桑籽发芽率[J].江苏蚕业，1977（3）：17.
[8] 盛海平，汪为民.水稻种子生活力四唑测定值与发芽率间的相关性[J].种子，2000（2）：30-31.