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摘要 [目的]建立一种超高效液相色谱快速测定茶叶中三氯杀螨醇的方法。[方法]采用Waters H-Class超高效液相色谱仪，ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），测定波长230 nm，流动相为A（甲醇）∶B（1%乙酸水）=90∶10，流速0.5 mL/min。茶叶中的三氯杀螨醇采用丙酮和正己烷进行提取，经浓硫酸净化和浓缩后，用甲醇定容后进行分析检测。[结果]三氯杀螨醇在0.05～1000 mg/L具有较好的线性关系（R2=0.999 2），检测限为0.05 mg/L。茶叶样品中添加3个浓度三氯杀螨醇的平均回收率为93.9%～106.0%，变异系数为3.3%～11.1%。[结论]该方法快速、准确、灵敏，可用于茶叶中三氯杀螨醇的分析检测。
关键词 超高效液相色谱;三氯杀螨醇;茶叶
中图分类号 O657.7;TS272.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0200-03
Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for the rapid determination of dicofol in tea by ultra performance liquid chromatography（UPLC）. [Method]The system composed of a Waters HClass UPLC and a ACQUITY UPLC BEH C18 column （100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）， and detection wavelength was set at 230 nm. The mobile phase was A （methanol）：B （water containing 1% acetic acid）=90∶10 and the flow rate was 0.5 mL/min. The dicofol residues in the tea were extracted by acetone and hexane， and purified by concentrated sulfuric acid. The final residues were fixed in methanol for detection. [Result]The good linear range was 0.05-10.00 mg/L （R2=0.999 2）. The limit of detection was 0.05 mg/L. The average recoveries of dicofol which were added into the tea were 93.9%-106.0% and variation coefficients （CVs） ranged from 3.3%-11.1%. [Conclusion]The method is rapid， accurate and high sensitivity， which can be used for the detection of dicofol in the tea.
Key words Ultra performance liquid chromatography;Dicofol;Tea
三氯杀螨醇是一种具有杀螨谱广、高效的有机氯杀螨剂，被广泛应用于蔬菜、果树和棉花等种植中病虫害的防治。但近年来研究发现，由于三氯杀螨醇具有不易分解、残留量高，对动物和人类有毒性和雌激素效应等作用而受到关注[1-3]。我国是茶叶产品生产和出口大国，大量茶叶因农药残留不达标而被阻止出口，其产生的绿色壁垒对我国茶叶出口贸易具有一定的制约作用[4-6]。目前，由于三氯杀螨醇使用效果显著，部分茶叶中仍可检出三氯杀螨醇，因此茶叶中三氯杀螨醇的残留情况越来越受到关注[7-8]。
三氯杀螨醇的检测方法主要有气相色谱法[9-10]、气相色谱-质谱联用法[11-12]和液相色谱法等[13-14]。气相色谱法为最常用的检测方法，灵敏度高，但检测时间较长;气相色谱-质谱联用法更为准确和灵敏，但其对仪器有较高的要求;液相色谱法是目前进出口茶叶中三氯杀螨醇残留量的检测方法，其检测准确度和灵敏度也相对较高。超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）是近年来快速发展的一种基于1.7 μm 颗粒度填料的液相色谱技术，比高效液相色谱分析速度更快更灵敏，具有更高的柱效、分析时间短、减少溶剂消耗等优点[15]，被广泛应用于中草药、农药和药物的检测分析[16-20]。笔者采用超高效液相色谱法，建立三氯杀螨醇残留量的检测方法，以期为检测茶叶中三氯杀螨醇残留量提供有效方法。
1 材料与方法
1.1 材料與仪器
三氯杀螨醇标准品购自上海源叶生物科技有限公司;甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
超高效液相色谱系统H-class，配二极管阵列检测器，美国Waters 公司。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件。
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温25 ℃，进样量5 μL，检测波长230 nm。流动相为A（甲醇）∶B（1%乙酸水）=90∶10;流速0.5 mL/min。
1.2.2 三氯杀螨醇标准曲线的绘制。
先配制三氯杀螨醇标准溶液10.0 mg/L，再稀释成一系列不同浓度的标准溶液（001、0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mg/L），在“1.2.1”色谱条件下进样检测，将不同三氯杀螨醇浓度与峰面积作图，计算出回归方程式。 1.2.3 茶叶中三氯杀螨醇的提取方法。
准确称取1.000 g茶叶样品于10 mL试管中，加入1.0 mL丙酮和2.0 mL正己烷。置于旋涡振荡器上剧烈振荡30 s。3 000 r/min离心2 min，将上清移入另一10 mL试管中。残渣再重复提取2次，将提取上清液合并。将合并的上清液置于恒温水浴中，60 ℃恒温蒸发、浓缩至4～5 mL，取出。往试管中缓慢加入1.5 mL浓硫酸，轻轻混匀后，3 500 r/min离心2 min，取出。将下层磺化液吸出，再加入1.5 mL浓硫酸，重复1次，最后将上清液移入一干净试管中，在取出上清液的原试管中再加入2.0 mL正己烷，混匀30 s，3 500 r/min离心2 min，取出，将上清液小心移入同一干净试管中。将试管于50 ℃恒温水浴中，空气流下，蒸干，准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，作为待测液。
1.2.4 加标回收率试验。
准确称取1.000 g未检出三氯杀螨醇的茶叶样品，向样品中添加三氯杀螨醇标准品（通过液体稀释后加入），得到0.1、1.0和10.0 mg/kg。按“1.2.3”的方法进行提取，进行液相分析。根据三氯杀螨醇标准曲线，计算出样品的三氯杀螨醇含量。每个样品设6个重复，以回收率和变异系数确定其准确度。
2 结果与分析
2.1 三氯杀螨醇标准曲线的绘制
按照“1.2.2”方法进行色谱检测，色谱结果如图1所示。从图1可以看出，在该色谱条件下，三氯杀螨醇标准品（1.0 mg/L）的保留时间为3386 min，峰型较好。不同浓度下测定的结果表明，在三氯杀螨0.05～10.00 mg/L具有较好的线性关系，线性方程为y=79.268x-0.803 4（R2=0.999 2），检测限为0.05 mg/L。茶叶样品中加入三氯杀螨醇标准品，提取后采用超高效液相色谱检测的色谱图见图2所示。从图2可以看出，提取后茶叶样品中的三氯杀螨醇峰型较好，未与其他杂质干扰，可用于茶叶样品中三氯杀螨醇的分析检测。
2.2 茶叶中三氯杀螨醇加标回收率
按照“1.2.4”方法操作，通过提取后采用超高效液相色谱仪进行测定样品的三氯杀螨醇含量，计算茶叶样品的三氯杀螨醇回收率，结果如表1所示。从表1可以看出，在添加3个浓度的三氯杀螨醇标准品的平均回收率为93.9%～106.0%，回收率较高，CV值 为33%～11.1%，具有较好的重复性。表明该研究建立的超高效液相色谱法检测具有较高的准确度和重复性。
3 讨论
近年来，随着经济全球化和贸易自由化的发展，各国对我国茶叶进入国际市场提出了更苛刻的要求，绿色贸易壁垒成为茶叶贸易出口的主要障碍[21-22]。我国农业部发布自2018年10月1日起，全面禁止三氯杀螨醇销售和使用，世界卫生组织国际癌症研究机构将三氯杀螨醇列在3类致癌物清单中。但由于长期以来茶树病虫的发生，而三氯杀螨醇的使用效果显著，目前仍有被违法使用于茶叶种植中，使得在部分茶叶中仍可检出三氯杀螨醇残留。河南省茶叶中重金属污染和农药残留状况调查分析，结果表明，茶叶中可检测到禁用农药三氯杀螨醇，检出率为5.00%[8]。可见，由于我国茶叶的农药残留问题长期以来未被得到重视和解决，导致大量茶叶因不达标而被阻止出口[23]。因此，建立快速、灵敏的农药残留检测方法是目前工作的一个重点。
目前，在茶叶的有机农药残留检测中，其中有机类农药包括有机氯农药、有机磷农药、有机金属类农药、氨基甲酸脂类农药和拟除虫菊酯类农药等[24]。多数具有热稳定、弱极性和挥发性的农药如有机磷、有机氯和拟除虫菊酯等则采用气相色谱法进行检测[25]，一些热不稳定或蒸汽压较低的杀虫剂，如氨基甲酸酯类和N-甲基氨基甲酸酯类，则可采用液相色谱法[26]。三氯杀螨醇报道的较多是气相色谱法，而液相色谱法报道的较少。倪晓琳等[13]建立了液相色谱法测定茶叶中三氯杀螨醇的方法，在0.1～10.0 mg/L具有良好的线性关系，检出限为0.02 mg/kg，加标回收率为95.4%～1052%，RSD为1.4%～5.5%，该方法操作简便、快速、准确度高。张雷等[14]建立了茶叶中三氯杀螨醇残留量的高效液相色谱快速检测方法，在0.02～5.00 mg/kg，三氯杀螨醇线性关系良好，在绿茶、红茶、黄茶、青茶、白茶、黑茶6种茶叶中的加标回收率为80.9%～108.3%，RSD为1.2%～140%。目前，已经有部分液相色谱法被应用于成品茶（干茶）和茶制品的农残定量分析[25]。
UPLC是以小颗粒填料（<2 μm）和超高压系统（>105 kPa）为特征的超高效液相色谱，可以获得更加高效和快速的色谱分离性能[27]。UPLC由于其具有的速度、灵敏度及分离度均比HPLC有数倍的提高，近年来被广泛应用于各种中药、药物、化妆品和环境等领域的分析检测中，而结合质谱的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）检测方法更被广泛应用于食品、蔬菜、水果和茶叶中多菌灵、啶虫脒、氟虫腈等氨基甲酸酯类和有机磷类等农药残留检测中[27-31]。因此，UPLC的应用越来越广泛。该研究应用UPLC建立的检测三氯杀螨醇的方法，出峰时间短、灵敏度高、重复性好，该方法可用于茶叶中三氯杀螨醇的快速檢测。
4 结论
该研究中采用UPLC建立了一种快速检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，三氯杀螨醇浓度在0.05～10.00 mg/L具有较好的线性范围，最低检测限为0.05 mg/L。茶叶样品中添加3个浓度的三氯杀螨醇平均回收率为93.9%～106.0%，CV值为3.3%～11.1%。该方法快速、准确、灵敏，可用于茶叶样品中三氯杀螨醇的分析检测。
参考文献
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关键词 超高效液相色谱;三氯杀螨醇;茶叶
中图分类号 O657.7;TS272.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0200-03
Abstract [Objective]The research aimed to establish a method for the rapid determination of dicofol in tea by ultra performance liquid chromatography（UPLC）. [Method]The system composed of a Waters HClass UPLC and a ACQUITY UPLC BEH C18 column （100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）， and detection wavelength was set at 230 nm. The mobile phase was A （methanol）：B （water containing 1% acetic acid）=90∶10 and the flow rate was 0.5 mL/min. The dicofol residues in the tea were extracted by acetone and hexane， and purified by concentrated sulfuric acid. The final residues were fixed in methanol for detection. [Result]The good linear range was 0.05-10.00 mg/L （R2=0.999 2）. The limit of detection was 0.05 mg/L. The average recoveries of dicofol which were added into the tea were 93.9%-106.0% and variation coefficients （CVs） ranged from 3.3%-11.1%. [Conclusion]The method is rapid， accurate and high sensitivity， which can be used for the detection of dicofol in the tea.
Key words Ultra performance liquid chromatography;Dicofol;Tea
三氯杀螨醇是一种具有杀螨谱广、高效的有机氯杀螨剂，被广泛应用于蔬菜、果树和棉花等种植中病虫害的防治。但近年来研究发现，由于三氯杀螨醇具有不易分解、残留量高，对动物和人类有毒性和雌激素效应等作用而受到关注[1-3]。我国是茶叶产品生产和出口大国，大量茶叶因农药残留不达标而被阻止出口，其产生的绿色壁垒对我国茶叶出口贸易具有一定的制约作用[4-6]。目前，由于三氯杀螨醇使用效果显著，部分茶叶中仍可检出三氯杀螨醇，因此茶叶中三氯杀螨醇的残留情况越来越受到关注[7-8]。
三氯杀螨醇的检测方法主要有气相色谱法[9-10]、气相色谱-质谱联用法[11-12]和液相色谱法等[13-14]。气相色谱法为最常用的检测方法，灵敏度高，但检测时间较长;气相色谱-质谱联用法更为准确和灵敏，但其对仪器有较高的要求;液相色谱法是目前进出口茶叶中三氯杀螨醇残留量的检测方法，其检测准确度和灵敏度也相对较高。超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）是近年来快速发展的一种基于1.7 μm 颗粒度填料的液相色谱技术，比高效液相色谱分析速度更快更灵敏，具有更高的柱效、分析时间短、减少溶剂消耗等优点[15]，被广泛应用于中草药、农药和药物的检测分析[16-20]。笔者采用超高效液相色谱法，建立三氯杀螨醇残留量的检测方法，以期为检测茶叶中三氯杀螨醇残留量提供有效方法。
1 材料与方法
1.1 材料與仪器
三氯杀螨醇标准品购自上海源叶生物科技有限公司;甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
超高效液相色谱系统H-class，配二极管阵列检测器，美国Waters 公司。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件。
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温25 ℃，进样量5 μL，检测波长230 nm。流动相为A（甲醇）∶B（1%乙酸水）=90∶10;流速0.5 mL/min。
1.2.2 三氯杀螨醇标准曲线的绘制。
先配制三氯杀螨醇标准溶液10.0 mg/L，再稀释成一系列不同浓度的标准溶液（001、0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mg/L），在“1.2.1”色谱条件下进样检测，将不同三氯杀螨醇浓度与峰面积作图，计算出回归方程式。 1.2.3 茶叶中三氯杀螨醇的提取方法。
准确称取1.000 g茶叶样品于10 mL试管中，加入1.0 mL丙酮和2.0 mL正己烷。置于旋涡振荡器上剧烈振荡30 s。3 000 r/min离心2 min，将上清移入另一10 mL试管中。残渣再重复提取2次，将提取上清液合并。将合并的上清液置于恒温水浴中，60 ℃恒温蒸发、浓缩至4～5 mL，取出。往试管中缓慢加入1.5 mL浓硫酸，轻轻混匀后，3 500 r/min离心2 min，取出。将下层磺化液吸出，再加入1.5 mL浓硫酸，重复1次，最后将上清液移入一干净试管中，在取出上清液的原试管中再加入2.0 mL正己烷，混匀30 s，3 500 r/min离心2 min，取出，将上清液小心移入同一干净试管中。将试管于50 ℃恒温水浴中，空气流下，蒸干，准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，作为待测液。
1.2.4 加标回收率试验。
准确称取1.000 g未检出三氯杀螨醇的茶叶样品，向样品中添加三氯杀螨醇标准品（通过液体稀释后加入），得到0.1、1.0和10.0 mg/kg。按“1.2.3”的方法进行提取，进行液相分析。根据三氯杀螨醇标准曲线，计算出样品的三氯杀螨醇含量。每个样品设6个重复，以回收率和变异系数确定其准确度。
2 结果与分析
2.1 三氯杀螨醇标准曲线的绘制
按照“1.2.2”方法进行色谱检测，色谱结果如图1所示。从图1可以看出，在该色谱条件下，三氯杀螨醇标准品（1.0 mg/L）的保留时间为3386 min，峰型较好。不同浓度下测定的结果表明，在三氯杀螨0.05～10.00 mg/L具有较好的线性关系，线性方程为y=79.268x-0.803 4（R2=0.999 2），检测限为0.05 mg/L。茶叶样品中加入三氯杀螨醇标准品，提取后采用超高效液相色谱检测的色谱图见图2所示。从图2可以看出，提取后茶叶样品中的三氯杀螨醇峰型较好，未与其他杂质干扰，可用于茶叶样品中三氯杀螨醇的分析检测。
2.2 茶叶中三氯杀螨醇加标回收率
按照“1.2.4”方法操作，通过提取后采用超高效液相色谱仪进行测定样品的三氯杀螨醇含量，计算茶叶样品的三氯杀螨醇回收率，结果如表1所示。从表1可以看出，在添加3个浓度的三氯杀螨醇标准品的平均回收率为93.9%～106.0%，回收率较高，CV值 为33%～11.1%，具有较好的重复性。表明该研究建立的超高效液相色谱法检测具有较高的准确度和重复性。
3 讨论
近年来，随着经济全球化和贸易自由化的发展，各国对我国茶叶进入国际市场提出了更苛刻的要求，绿色贸易壁垒成为茶叶贸易出口的主要障碍[21-22]。我国农业部发布自2018年10月1日起，全面禁止三氯杀螨醇销售和使用，世界卫生组织国际癌症研究机构将三氯杀螨醇列在3类致癌物清单中。但由于长期以来茶树病虫的发生，而三氯杀螨醇的使用效果显著，目前仍有被违法使用于茶叶种植中，使得在部分茶叶中仍可检出三氯杀螨醇残留。河南省茶叶中重金属污染和农药残留状况调查分析，结果表明，茶叶中可检测到禁用农药三氯杀螨醇，检出率为5.00%[8]。可见，由于我国茶叶的农药残留问题长期以来未被得到重视和解决，导致大量茶叶因不达标而被阻止出口[23]。因此，建立快速、灵敏的农药残留检测方法是目前工作的一个重点。
目前，在茶叶的有机农药残留检测中，其中有机类农药包括有机氯农药、有机磷农药、有机金属类农药、氨基甲酸脂类农药和拟除虫菊酯类农药等[24]。多数具有热稳定、弱极性和挥发性的农药如有机磷、有机氯和拟除虫菊酯等则采用气相色谱法进行检测[25]，一些热不稳定或蒸汽压较低的杀虫剂，如氨基甲酸酯类和N-甲基氨基甲酸酯类，则可采用液相色谱法[26]。三氯杀螨醇报道的较多是气相色谱法，而液相色谱法报道的较少。倪晓琳等[13]建立了液相色谱法测定茶叶中三氯杀螨醇的方法，在0.1～10.0 mg/L具有良好的线性关系，检出限为0.02 mg/kg，加标回收率为95.4%～1052%，RSD为1.4%～5.5%，该方法操作简便、快速、准确度高。张雷等[14]建立了茶叶中三氯杀螨醇残留量的高效液相色谱快速检测方法，在0.02～5.00 mg/kg，三氯杀螨醇线性关系良好，在绿茶、红茶、黄茶、青茶、白茶、黑茶6种茶叶中的加标回收率为80.9%～108.3%，RSD为1.2%～140%。目前，已经有部分液相色谱法被应用于成品茶（干茶）和茶制品的农残定量分析[25]。
UPLC是以小颗粒填料（<2 μm）和超高压系统（>105 kPa）为特征的超高效液相色谱，可以获得更加高效和快速的色谱分离性能[27]。UPLC由于其具有的速度、灵敏度及分离度均比HPLC有数倍的提高，近年来被广泛应用于各种中药、药物、化妆品和环境等领域的分析检测中，而结合质谱的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）检测方法更被广泛应用于食品、蔬菜、水果和茶叶中多菌灵、啶虫脒、氟虫腈等氨基甲酸酯类和有机磷类等农药残留检测中[27-31]。因此，UPLC的应用越来越广泛。该研究应用UPLC建立的检测三氯杀螨醇的方法，出峰时间短、灵敏度高、重复性好，该方法可用于茶叶中三氯杀螨醇的快速檢测。
4 结论
该研究中采用UPLC建立了一种快速检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，三氯杀螨醇浓度在0.05～10.00 mg/L具有较好的线性范围，最低检测限为0.05 mg/L。茶叶样品中添加3个浓度的三氯杀螨醇平均回收率为93.9%～106.0%，CV值为3.3%～11.1%。该方法快速、准确、灵敏，可用于茶叶样品中三氯杀螨醇的分析检测。
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