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为保证应用咖啡因代谢探针的正确性，建立了反相高效液相色谱测定尿中在咖啡因代谢物的方法。采用日本岛津Ｓｈｉｍ Ｐａｃｋ ＣＬＣ－ＯＤＳ柱，以甲醇－乙腈－０．０５％醋酸为流动相，咖啡因和它的１３种代谢物及内标均能良好分离。重点对其中５个主要代谢物ＡＦＭＵ，１Ｕ，１Ｘ，１７Ｕ，１７Ｘ进行了测定。结果表明这５种代谢物回收率均在８７５以上，日内和日间误差均小于３％，显示了方法的稳定性。