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摘要：目的：探讨分析凝集素芯片检验糖蛋白的方法与应用。
方法：用染色液Cy3标记标准糖蛋白，血清白蛋白，应用凝集素识别特异糖链的原理建立方法，同时分析肝细胞及癌细胞膜蛋白的差异。
结果：最优封闭剂为含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液。最佳孵育条件为60%湿度的培养箱孵育3小时，真空干燥箱37℃干燥3小时。最佳孵育缓冲液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L。在显微镜下观察，不同结合位点的细胞形态不一，且肝癌细胞的增殖速度较快。凝集素芯片检验糖蛋白结果和标准的糖蛋白链组成一致，证明了芯片检测的可行性。
结论：凝集素芯片检测糖蛋白可以时时动态的，且稳定性和特异性较好，为以后的细胞癌变等进一步研究提供依据，值得推广使用。
关键词：凝集素芯片糖蛋白肝细胞膜蛋白
【中图分类号】R9【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）03-0287-02
凝集素芯片是近年发展起来的用于生化检测技术的一种手段，具有一定优越性，具体报告如下：
1资料与方法
1.1资料。所用试剂：凝集素（Sigma）；牛血清白蛋白（北京鼎国生物技术）；染色液（GE）；正常人肝细胞（中国医科大学附属医院血站）；玻璃载片（Gold Seal）；其余试剂均分析纯以上。
所用仪器：芯片点样仪购于英国MicroGridⅡ，BioRobiotics公司；激光共聚焦扫描仪购于美国Gene TACTM LS IV公司；低温离心机购于美国SIGMA公司；显微镜（Microscpoe ECLIPSE 80psi）购于日本Nikon公司；真空干燥箱购于上海一恒公司；培养箱购于上海一恒。
1.2方法[1，2]。凝集素芯片的制备方法：依据厂家推荐的方法制备凝集素芯片，选用1g/L的牛血清白蛋白作为阴性对照，染色液Cy3标记的牛血清白蛋白作Marker，配成1μg/L点样浓度的凝集素，应用晶芯48点的芯片点样仪在环氧修饰的玻璃载片上点样，之后60%湿度的培养箱中孵育3小时，真空干燥箱37℃干燥3小时。用加入0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液10mmol/L和10mmol/L磷酸盐缓冲液各清洗玻璃载片1次，再用含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液封闭芯片1小时。之后再用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L和10mmol/L磷酸盐缓冲液清洗玻璃载片2分钟，最后用离心机甩干芯片，放入冰箱中冷藏备用。
1.3数据的扫描与分析。用激光共聚焦扫描仪扫描芯片，设定PMT光电倍增管为70%。先预扫描，之后选择适合大小的点样区域精确扫描。为达到清晰的视觉效果，调节对比度及明亮度。利用软件对扫描结果图进行分析。
2结果
2.1封闭条件。选择表面无糖链结构的蛋白质，确定的最优封闭剂为含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液。
2.2孵育条件。最佳孵育条件为60%湿度的培养箱孵育3小时，真空干燥箱37℃干燥3小时。缓冲液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L。
2.3镜检结果。将捕获细胞的凝集素芯片直接放在显微镜下观察，不同结合位点的细胞形态不一，且肝癌细胞的增殖速度较快。
2.4凝集素芯片识别糖蛋白。凝集素芯片检验糖蛋白结果和标准的糖蛋白链组成一致，证明了芯片检测的可行性[3]。
3讨论
近年来，蛋白质糖基化受到重视。蛋白质糖基化是一种翻译后修饰产物，在微生物感染，细胞癌变，细胞分化等方面起着重要作用。凝集素芯片一种快速，简便，高通量的检测手段，通过与蛋白糖链的特异性结合而受到关注，加速了蛋白质糖基化的研究进展。并通过监测癌细胞的变化而为日后的病情控制提供依据[4]。综上所述，凝集素芯片检测糖蛋白的动态性，稳定性，特异性较好，为以后的细胞癌变等进一步研究提供依据，值得推广使用。
参考文献
[1]何群，宋春阳，张艳，等.细胞膜表面糖识别芯片的制备及其初步应用.中国医科大学学报，2008，37（5）：577-579
[2]Thomas I，Andreas B，Katharina P，et al.Specificity analysis of lectins and antibodies using remodeled glycoproteins.Anal Biochem，2009，386（2）：133-146
[3]Sumiyoshi M，Ricciuto J，Tisdale A，et al.Antiadhesive character of mucin O-glycans at the apical surface of corneal epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49（1）：197-203
[4]Miyagi T，Wada T，Yamaguchi K，et al.Human sialidase as a cancer marker.Proteomics，2008，8（16）：3303-3311
方法：用染色液Cy3标记标准糖蛋白，血清白蛋白，应用凝集素识别特异糖链的原理建立方法，同时分析肝细胞及癌细胞膜蛋白的差异。
结果：最优封闭剂为含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液。最佳孵育条件为60%湿度的培养箱孵育3小时，真空干燥箱37℃干燥3小时。最佳孵育缓冲液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L。在显微镜下观察，不同结合位点的细胞形态不一，且肝癌细胞的增殖速度较快。凝集素芯片检验糖蛋白结果和标准的糖蛋白链组成一致，证明了芯片检测的可行性。
结论：凝集素芯片检测糖蛋白可以时时动态的，且稳定性和特异性较好，为以后的细胞癌变等进一步研究提供依据，值得推广使用。
关键词：凝集素芯片糖蛋白肝细胞膜蛋白
【中图分类号】R9【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）03-0287-02
凝集素芯片是近年发展起来的用于生化检测技术的一种手段，具有一定优越性，具体报告如下：
1资料与方法
1.1资料。所用试剂：凝集素（Sigma）；牛血清白蛋白（北京鼎国生物技术）；染色液（GE）；正常人肝细胞（中国医科大学附属医院血站）；玻璃载片（Gold Seal）；其余试剂均分析纯以上。
所用仪器：芯片点样仪购于英国MicroGridⅡ，BioRobiotics公司；激光共聚焦扫描仪购于美国Gene TACTM LS IV公司；低温离心机购于美国SIGMA公司；显微镜（Microscpoe ECLIPSE 80psi）购于日本Nikon公司；真空干燥箱购于上海一恒公司；培养箱购于上海一恒。
1.2方法[1，2]。凝集素芯片的制备方法：依据厂家推荐的方法制备凝集素芯片，选用1g/L的牛血清白蛋白作为阴性对照，染色液Cy3标记的牛血清白蛋白作Marker，配成1μg/L点样浓度的凝集素，应用晶芯48点的芯片点样仪在环氧修饰的玻璃载片上点样，之后60%湿度的培养箱中孵育3小时，真空干燥箱37℃干燥3小时。用加入0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液10mmol/L和10mmol/L磷酸盐缓冲液各清洗玻璃载片1次，再用含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液封闭芯片1小时。之后再用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L和10mmol/L磷酸盐缓冲液清洗玻璃载片2分钟，最后用离心机甩干芯片，放入冰箱中冷藏备用。
1.3数据的扫描与分析。用激光共聚焦扫描仪扫描芯片，设定PMT光电倍增管为70%。先预扫描，之后选择适合大小的点样区域精确扫描。为达到清晰的视觉效果，调节对比度及明亮度。利用软件对扫描结果图进行分析。
2结果
2.1封闭条件。选择表面无糖链结构的蛋白质，确定的最优封闭剂为含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液。
2.2孵育条件。最佳孵育条件为60%湿度的培养箱孵育3小时，真空干燥箱37℃干燥3小时。缓冲液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L。
2.3镜检结果。将捕获细胞的凝集素芯片直接放在显微镜下观察，不同结合位点的细胞形态不一，且肝癌细胞的增殖速度较快。
2.4凝集素芯片识别糖蛋白。凝集素芯片检验糖蛋白结果和标准的糖蛋白链组成一致，证明了芯片检测的可行性[3]。
3讨论
近年来，蛋白质糖基化受到重视。蛋白质糖基化是一种翻译后修饰产物，在微生物感染，细胞癌变，细胞分化等方面起着重要作用。凝集素芯片一种快速，简便，高通量的检测手段，通过与蛋白糖链的特异性结合而受到关注，加速了蛋白质糖基化的研究进展。并通过监测癌细胞的变化而为日后的病情控制提供依据[4]。综上所述，凝集素芯片检测糖蛋白的动态性，稳定性，特异性较好，为以后的细胞癌变等进一步研究提供依据，值得推广使用。
参考文献
[1]何群，宋春阳，张艳，等.细胞膜表面糖识别芯片的制备及其初步应用.中国医科大学学报，2008，37（5）：577-579
[2]Thomas I，Andreas B，Katharina P，et al.Specificity analysis of lectins and antibodies using remodeled glycoproteins.Anal Biochem，2009，386（2）：133-146
[3]Sumiyoshi M，Ricciuto J，Tisdale A，et al.Antiadhesive character of mucin O-glycans at the apical surface of corneal epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49（1）：197-203
[4]Miyagi T，Wada T，Yamaguchi K，et al.Human sialidase as a cancer marker.Proteomics，2008，8（16）：3303-3311