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【摘要】 目的：通过成功复制小鼠肺纤维化模型，探讨肺靶向参芎明胶微球对肺间质纤维化的影响，从而找到解决肺纤维化的有效治疗方法。方法：选取60只健康小鼠，随机分为三组，正常对照组、参芎明胶微球药物治疗组、模型组各20只。通过病理观察判断模型成功与否，以及测定肺组织转化生长因子β（Transforming growth factorβ， TGFβ）积分光密度值（IOD），来确定参芎明胶微球治疗干预肺纤维化的疗效。结果：模型组肺组织TGFβ1 IOD值明显高于参芎明胶微球药物治疗组，比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：参芎明胶微球可降低肺纤维化小鼠早期TGFβ1在肺组织的表达，对小鼠肺纤维化有一定的抑制作用。
【关键词】 参芎明胶微球； 肺间质纤维化； 转化生长因子β
丹参为唇形科多年生草本植物丹参的根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦，有减轻心肌、脑缺血再灌注损伤，抑制血小板凝聚和血栓形成，抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白降解，清除自由基等药理作用。川芎为伞形科蒿木属植物的根茎，功能为活血行气，消散淤血，祛风止痛。
间质性肺纤维化（interstitial lung disease， ILD）是一组主要累及肺间质、肺泡和（或）细支气管的肺部弥漫性疾病，通常亦称作弥漫性实质性肺疾病（DPLD）[1]。丹参、川芎是非常有使用前景的抗纤维化药物，本实验采用现代靶向制剂技术，以生物降解型高分子材料明胶为载体制成肺靶向参芎明胶微球，控制粒径在7～30 μm范围内，经静脉注射给药，使参芎明胶微球最大限度靶向浓集于肺组织，提高肺部病变部位药物浓度，有利于其发挥药理作用。TGFβ具有多种生物学效应，其来源于肺巨噬细胞和上皮细胞，可刺激未成熟成纤维细胞的生长，对成纤维细胞具有趋化作用[2]，以加速肺纤维化发展。TGFβ在哺乳类动物中共有三种异构体，即TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，其中TGFβ1分布最广，研究得也最多。体外研究表明，TGFβ1可刺激肺成纤维细胞合成大量胶原[2]。目前参芎明胶微球制剂对TGFβ1的干预研究尚未见报道，笔者为开发此药提供部分实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 丹参素钠（标准品）、盐酸川芎嗪（标准品）购自大连美仑生物技术有限公司；兔多克隆抗体TGFβ1即用型SABC试剂盒，DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）。722型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产。
1.2 实验动物 选取60只健康小鼠，雌雄各半，随机分为三组，正常对照组、参芎明胶微球药物治疗组、模型组。每组20只。
1.3 参芎明胶微球制备 称取丹参素钠、盐酸川芎嗪各0.5 g，明胶6 g，将明胶加入到60 ml蒸馏水中，置60 ℃水浴上完全溶解，将丹参素钠、盐酸川芎嗪缓慢加入到上述溶液中，充分搅拌形成水相；然后加入到含有span-80 7.2 ml，液体石蜡360 ml的油相中，滴加时油相保持在（60±1）℃，乳化15 min，控制转速750 r/min。迅速放入冰水浴中，降至5 ℃以下，加入甲醛60 ml，搅拌下固化1 h，然后加入120 ml异丙醇脱水1 h，用丙酮和石油醚交替洗涤3次，抽滤，真空干燥24 h，即得棕黄色粉末状微球。光学显微镜显示：微球呈球形，表面光滑，粒径分布较窄、分散性好，不粘连或极少粘连，流动性好。
1.4 造模 实验小鼠用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后，取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝性分离暴露气管，模型组、参芎明胶微球药物治疗组小鼠于气管软骨环间隙穿刺缓缓注入博莱霉素（5 mg/kg）[3]，正常对照组注入等体积生理盐水。
1.5 给药方法 参芎明胶微球药物治疗组于造模后次日开始灌服给药40 mg/（kg·d），正常对照组与模型组灌服蒸馏水。
1.6 检测指标与方法 将小鼠处死后，取出两肺。应用免疫组织化学技术，检测TGFβ1在肺组织的表达。采用PAS9000 病理图像分析系统，用积分光密度（IOD）来衡量肺组织中TGF-β1的含量。每张切片选取5个高倍视野（×400），以巨噬细胞胞浆染为棕色、棕黄色、褐色为阳性细胞，计数阳性细胞数/高倍视野[4]，进行定量分析，根据免疫组化阳性着色的深浅计算每个视野的IOD[5]，求平均值。
1.7 病理观察 肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，按四级分类法评价肺脏病变程度，进行常规病理学检查[1]。
1.8 统计学处理 使用PEMS 3.1统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同时间小鼠肺组织TGFβ1阳性细胞IOD值 模型组小鼠在10 d肺泡腔和间质中可出现大量的TGFβ1阳性的单个或成群的肺泡巨噬细胞（P<0.01），20 d和30 d时在肺泡腔和间质中TGFβ1阳性的肺泡巨噬细胞数目减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。参芎明胶微球治疗后TGFβ1 IOD值比模型组降低，第10、20天比较差异有统计学意义。见表1。
2.2 病理学形态观察
2.2.1 大体观察 正常对照组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性较好。模型组小鼠第10天双肺呈暗红色，体积较大，弹性差；第20、30天时双肺苍白，体积缩小，硬度增加，参芎明胶微球药物治疗组轻于模型组。
2.2.2 光镜观察 正常对照组肺组织结构清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整。模型组10 d时肺泡炎明显，肺泡间隔增宽，可见少量成纤维细胞及其基质增生；20 d时肺泡炎减轻，肺泡间隔见成纤维细胞及基质大量增多；30 d时肺泡炎轻微，肺泡间隔显著增宽，可见大量成纤维细胞及胶原纤维增生。参芎明胶微球治疗组小鼠肺泡间隔增宽较模型组明显减轻，肺泡结构基本正常，与模型组相比纤维化程度均有不同程度减轻。 3 讨论
肺纤维化的病因目前尚不清楚。一般认为粉尘吸入、感染、吸入某些气体以及使用某些药物均可引起肺纤维化。本实验应用博莱霉素复制小鼠肺纤维化模型，观察发现模型组病理学改变10 d肺泡炎明显，20 d、30 d形成纤维化，说明动物模型复制成功。实验结果表明，TGFβ1表达在胞浆，表达的细胞有肺泡巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞等。正常对照组小鼠的少数细支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞等胞浆有少量阳性表达；模型组小鼠细支气管黏膜上皮细胞肺泡上皮细胞、血管内皮细胞TGFβ1表达明显；参芎明胶微球药物治疗组小鼠表达较模型组减少。与正常对照组相比模型组小鼠在10 d肺泡腔和间质中出现大量的TGFβ1阳性的细胞（P<0.01），以单个或成群肺泡巨噬细胞为主，20 d和30 d时在肺泡腔和间质中TGFβ1阳性的肺泡巨噬细胞数目减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），反映了参芎明胶微球能抑制TGFβ1的大量释放，起到调节细胞因子网络的作用，进而减轻肺纤维化。本实验证实参芎明胶微球对小鼠肺纤维化有一定的抑制作用。
参考文献
[1]王海斌.特发性肺纤维化治疗现状与进展[J].国外医学：呼吸系统分册，1999，19（2）：100-101.
[2] Coker R K， Laurent G J. Pulmonary fibrosis： cytokines in the balance[J]. Eur Respir J，1998，11（6）：1218-1221.
[3] Slater T F. BLM induced Pulmonary fibrosis in hamster[J].Boiehem J，1984，222（2）：l.
[4] Mutsaers S E， Foster M L， Chambers R C， et al. Increased endothelin-1 and its localization during the development of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，1998，18（5）：611-619.
[5]叶燕青，徐启勇，杨亦斌.当归注射液对大鼠肺纤维化胶原蛋白含量的影响[J].医学新知杂志，2004，14（4）：235-236.
（收稿日期：2013-07-15） （本文编辑：王宇）
【关键词】 参芎明胶微球； 肺间质纤维化； 转化生长因子β
丹参为唇形科多年生草本植物丹参的根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦，有减轻心肌、脑缺血再灌注损伤，抑制血小板凝聚和血栓形成，抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白降解，清除自由基等药理作用。川芎为伞形科蒿木属植物的根茎，功能为活血行气，消散淤血，祛风止痛。
间质性肺纤维化（interstitial lung disease， ILD）是一组主要累及肺间质、肺泡和（或）细支气管的肺部弥漫性疾病，通常亦称作弥漫性实质性肺疾病（DPLD）[1]。丹参、川芎是非常有使用前景的抗纤维化药物，本实验采用现代靶向制剂技术，以生物降解型高分子材料明胶为载体制成肺靶向参芎明胶微球，控制粒径在7～30 μm范围内，经静脉注射给药，使参芎明胶微球最大限度靶向浓集于肺组织，提高肺部病变部位药物浓度，有利于其发挥药理作用。TGFβ具有多种生物学效应，其来源于肺巨噬细胞和上皮细胞，可刺激未成熟成纤维细胞的生长，对成纤维细胞具有趋化作用[2]，以加速肺纤维化发展。TGFβ在哺乳类动物中共有三种异构体，即TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，其中TGFβ1分布最广，研究得也最多。体外研究表明，TGFβ1可刺激肺成纤维细胞合成大量胶原[2]。目前参芎明胶微球制剂对TGFβ1的干预研究尚未见报道，笔者为开发此药提供部分实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 丹参素钠（标准品）、盐酸川芎嗪（标准品）购自大连美仑生物技术有限公司；兔多克隆抗体TGFβ1即用型SABC试剂盒，DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）。722型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产。
1.2 实验动物 选取60只健康小鼠，雌雄各半，随机分为三组，正常对照组、参芎明胶微球药物治疗组、模型组。每组20只。
1.3 参芎明胶微球制备 称取丹参素钠、盐酸川芎嗪各0.5 g，明胶6 g，将明胶加入到60 ml蒸馏水中，置60 ℃水浴上完全溶解，将丹参素钠、盐酸川芎嗪缓慢加入到上述溶液中，充分搅拌形成水相；然后加入到含有span-80 7.2 ml，液体石蜡360 ml的油相中，滴加时油相保持在（60±1）℃，乳化15 min，控制转速750 r/min。迅速放入冰水浴中，降至5 ℃以下，加入甲醛60 ml，搅拌下固化1 h，然后加入120 ml异丙醇脱水1 h，用丙酮和石油醚交替洗涤3次，抽滤，真空干燥24 h，即得棕黄色粉末状微球。光学显微镜显示：微球呈球形，表面光滑，粒径分布较窄、分散性好，不粘连或极少粘连，流动性好。
1.4 造模 实验小鼠用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后，取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝性分离暴露气管，模型组、参芎明胶微球药物治疗组小鼠于气管软骨环间隙穿刺缓缓注入博莱霉素（5 mg/kg）[3]，正常对照组注入等体积生理盐水。
1.5 给药方法 参芎明胶微球药物治疗组于造模后次日开始灌服给药40 mg/（kg·d），正常对照组与模型组灌服蒸馏水。
1.6 检测指标与方法 将小鼠处死后，取出两肺。应用免疫组织化学技术，检测TGFβ1在肺组织的表达。采用PAS9000 病理图像分析系统，用积分光密度（IOD）来衡量肺组织中TGF-β1的含量。每张切片选取5个高倍视野（×400），以巨噬细胞胞浆染为棕色、棕黄色、褐色为阳性细胞，计数阳性细胞数/高倍视野[4]，进行定量分析，根据免疫组化阳性着色的深浅计算每个视野的IOD[5]，求平均值。
1.7 病理观察 肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，按四级分类法评价肺脏病变程度，进行常规病理学检查[1]。
1.8 统计学处理 使用PEMS 3.1统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同时间小鼠肺组织TGFβ1阳性细胞IOD值 模型组小鼠在10 d肺泡腔和间质中可出现大量的TGFβ1阳性的单个或成群的肺泡巨噬细胞（P<0.01），20 d和30 d时在肺泡腔和间质中TGFβ1阳性的肺泡巨噬细胞数目减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。参芎明胶微球治疗后TGFβ1 IOD值比模型组降低，第10、20天比较差异有统计学意义。见表1。
2.2 病理学形态观察
2.2.1 大体观察 正常对照组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性较好。模型组小鼠第10天双肺呈暗红色，体积较大，弹性差；第20、30天时双肺苍白，体积缩小，硬度增加，参芎明胶微球药物治疗组轻于模型组。
2.2.2 光镜观察 正常对照组肺组织结构清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整。模型组10 d时肺泡炎明显，肺泡间隔增宽，可见少量成纤维细胞及其基质增生；20 d时肺泡炎减轻，肺泡间隔见成纤维细胞及基质大量增多；30 d时肺泡炎轻微，肺泡间隔显著增宽，可见大量成纤维细胞及胶原纤维增生。参芎明胶微球治疗组小鼠肺泡间隔增宽较模型组明显减轻，肺泡结构基本正常，与模型组相比纤维化程度均有不同程度减轻。 3 讨论
肺纤维化的病因目前尚不清楚。一般认为粉尘吸入、感染、吸入某些气体以及使用某些药物均可引起肺纤维化。本实验应用博莱霉素复制小鼠肺纤维化模型，观察发现模型组病理学改变10 d肺泡炎明显，20 d、30 d形成纤维化，说明动物模型复制成功。实验结果表明，TGFβ1表达在胞浆，表达的细胞有肺泡巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞等。正常对照组小鼠的少数细支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞等胞浆有少量阳性表达；模型组小鼠细支气管黏膜上皮细胞肺泡上皮细胞、血管内皮细胞TGFβ1表达明显；参芎明胶微球药物治疗组小鼠表达较模型组减少。与正常对照组相比模型组小鼠在10 d肺泡腔和间质中出现大量的TGFβ1阳性的细胞（P<0.01），以单个或成群肺泡巨噬细胞为主，20 d和30 d时在肺泡腔和间质中TGFβ1阳性的肺泡巨噬细胞数目减少，与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.01），反映了参芎明胶微球能抑制TGFβ1的大量释放，起到调节细胞因子网络的作用，进而减轻肺纤维化。本实验证实参芎明胶微球对小鼠肺纤维化有一定的抑制作用。
参考文献
[1]王海斌.特发性肺纤维化治疗现状与进展[J].国外医学：呼吸系统分册，1999，19（2）：100-101.
[2] Coker R K， Laurent G J. Pulmonary fibrosis： cytokines in the balance[J]. Eur Respir J，1998，11（6）：1218-1221.
[3] Slater T F. BLM induced Pulmonary fibrosis in hamster[J].Boiehem J，1984，222（2）：l.
[4] Mutsaers S E， Foster M L， Chambers R C， et al. Increased endothelin-1 and its localization during the development of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，1998，18（5）：611-619.
[5]叶燕青，徐启勇，杨亦斌.当归注射液对大鼠肺纤维化胶原蛋白含量的影响[J].医学新知杂志，2004，14（4）：235-236.
（收稿日期：2013-07-15） （本文编辑：王宇）