【摘 要】
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目的 建立一种经济快速、准确灵敏的非洲猪瘟病毒（ASFV）荧光定量PCR检测方法。方法 对30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对，根据其保守区域设计两对特异性引物，PCR扩增P72基因。以含ASFV P72基因保守区域的目的片段的重组标准质粒PUC57-P72为模板，建立荧光染料TB Green qPCR方法，绘制标准曲线并筛选最佳引物对。通过优化反应体系和条件，提高最佳引物对的检测灵
【机 构】
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陆军军医大学基础医学院军事生物安全教研室
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.81570497）；
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目的 建立一种经济快速、准确灵敏的非洲猪瘟病毒（ASFV）荧光定量PCR检测方法。方法 对30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对，根据其保守区域设计两对特异性引物，PCR扩增P72基因。以含ASFV P72基因保守区域的目的片段的重组标准质粒PUC57-P72为模板，建立荧光染料TB Green qPCR方法，绘制标准曲线并筛选最佳引物对。通过优化反应体系和条件，提高最佳引物对的检测灵敏性，并进行重复性检测。选用常见猪病毒如猪流感病毒H1N1、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）的核酸与ASFV标准质粒为模板进行特异性试验；通过检测已知ASFV阳性和阴性参考样品评估方法的符合率。结果 优选的基于P72基因的特异性引物对及反应体系，能扩增1.0～1.0×10~6 copies/μL的ASFV P72标准质粒，建立的标准曲线R~2可达0.9954;该方法最低可检测到1 copyies/μL的目的基因，优于TaqMan探针法扩增灵敏度；该方法的扩增反应采用两步法，耗时<1 h;方法的批内变异系数<1%,批间变异系数<2%;该方法针对ASFV扩增的特异性强，检测其它4种常见猪病毒均未发生交叉阳性反应；用该方法检测4份随机抽取的ASFV灭活参考样品均阳性，4份SPF级的巴拿马香猪组织样品均阴性，符合率为100%。结论 建立的TB Green qPCR方法经济、快速，灵敏、特异，可作为非洲猪瘟的分子诊断方法。
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