【摘 要】
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紫外分光光度法是测定脂肪氧化酶活力的常用方法,但其测定准确度受到底物溶液透明度和酶液纯度的制约,尤其在反应缓冲体系的pH低于7.0的条件下,难以进行粗酶液中LOX活力的直
【基金项目】
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江苏省重大科技成果转化项目(BA2009111)
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紫外分光光度法是测定脂肪氧化酶活力的常用方法,但其测定准确度受到底物溶液透明度和酶液纯度的制约,尤其在反应缓冲体系的pH低于7.0的条件下,难以进行粗酶液中LOX活力的直接测定。为克服现有方法的不足,本文建立一种改良的米糠中LOX紫外光谱检测方法。首先对米糠进行脱脂处理,提高方法的检测限与精确度;采用"磷酸盐溶液-亚油酸-吐温20"体系,简单、快速地获得透明的底物溶液;在获取米糠粗酶液LOX酶学特性的基础上,通过选择合适pH的缓冲体系,确保底物溶液的相对稳定;以"磷酸盐缓冲液+底物溶液+钝化的LOX溶液"为参比,省去繁杂的酶纯化步骤。结果表明:部分脱脂对米糠中脂肪氧化酶起到激活作用,其活力最高增加了46.33%;米糠LOX最适pH7.5,最适温度35℃;其活力测定的条件为:反应缓冲体系为2.0mL0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)、200μL底物溶液,其中亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53×10-3mol/L、1.68×10-3mol/L,测定温度25℃。此优化条件下,粗酶液添加量在10～40μL范围,反应速率与酶浓度呈正比,△OD234/min=0.001V-0.0026(R2=0.9996);米糠LOX酶促反应最大速率Vmax=0.136△A/min,米氏常量Km=11.592×10-3mol/L。该方法能简便、快速和准确地进行米糠中LOX的活力测定以及酶钝化动力学研究。
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