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摘要：试验采用沙基培养的方法研究了硝酸镧浸种与土施亚硒酸钠处理对高浓度铜盐胁迫下济麦22、山农28幼苗叶片SOD、POD活性以及可溶性蛋白含量的影响。结果表明，100 mg/L硫酸铜处理降低了小麦叶片SOD和POD活性、使可溶性蛋白含量升高，对小麦幼苗造成了毒害。镧浸种缓解济麦22和山农28铜胁迫条件下幼苗抗氧化酶活性抑制的最适浓度范围分别为30～50 mg/L和30～100 mg/L；土施亚硒酸钠缓解二者抗氧化酶活性的最适浓度范围分别为15～25 mg/L和5～25 mg/L；镧浸种和亚硒酸钠复合处理缓解二者抗氧化酶活性的适宜浓度分别为100 mg/L镧浸种+5～25 mg/L亚硒酸钠和50 mg/L镧浸种+5～25 mg/L亚硒酸钠。兩品种小麦对镧浸种及土施亚硒酸钠溶液浓度的敏感性存在差异，山农28抗氧化酶系统抵抗高浓度铜盐胁迫的能力强于济麦22。镧浸种和亚硒酸钠处理对于高浓度铜盐胁迫幼苗的单独效应及二者的复合效应，均对两品种小麦的SOD、POD活性产生了“低促高抑”的影响，镧浸种处理提高了小麦幼苗对亚硒酸钠的耐受能力，并且二者的复合作用对增强SOD及POD活性具有互补性。试验统计结果表明，镧和硒可能并不通过促进SOD酶合成基因表达，而是通过改变构象或以进行化学修饰的方式提高活性，剂量的影响遵循Hormesis效应的变化规律。适当浓度的镧浸种和土施亚硒酸钠的复合处理能有效缓解铜胁迫对小麦幼苗的氧化伤害。
关键词：小麦；镧；硒；铜胁迫；抗氧化酶；可溶性蛋白
中图分类号：S512.1+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0064-09
Abstract The effects of seed soaking with lanthanum nitrate and watering sodium selenite on the SOD and POD activities and soluble protein content in Jimai 22 and Shannong 28 seedling leaves under copper stress were investigated using the sandculture method. The results showed that 100 mg/L copper sulfate treatment reduced the activities of SOD and POD and increased the content of soluble protein in wheat leaves， which poisoned wheat seedlings. For relieving the inhibition to antioxidase activity in Jimai 22 and Shannong 28 under copper stress， the optimum soaking concentration of lanthanum nitrate were 30～50 mg/L and 30～100 mg/L， and the optimum watering concentration of sodium selenite were 15～25 mg/L and 5～25 mg/L， and the optimum compound treatment conditions were 100 mg/L lanthanum with 5 ～ 25 mg/L sodium selenite and 50 mg/L lanthanum with 5～25 mg/L sodium selenite， respectively. The sensitivity of the two wheat variety to lanthanum soaking and watering sodium selenite solution was different. Shannong 28 had better antioxidase system to resist high concentration copper stress. The single and compound effects of lanthanum seed soaking and watering sodium selenite on the SOD and POD activities of the two wheat variety seedlings under the high concentration of copper stress showed promoting at low concentration and inhibiting at high concentration. Lanthanum soaking treatment improved the tolerance of wheat seedlings to sodium selenite，and their compound effects were complementary on enhancing the SOD and POD activities. These results indicated that lanthanum and selenium might increase the activity by not promoting the expression of SOD synthase genes， but by conformation changing or chemical modification， and the effects of dose followed the Hormesis effect. We concluded that soaking seeds with lanthanum and watering sodium selenite solution at optimum concentration could effectively relieve the oxidative damage to wheat seedlings under copper stress. Keywords Wheat； Lanthanum； Selenium； Copper stress； Antioxidase； Soluble protein
我国稀土资源丰富，无论是种类还是储量均居世界前列[1]。稀土在农业上的应用有着巨大的潜力[2]。研究表明，稀土元素特别是轻稀土元素（如镧、钕等）在促进作物生长、提高其抵抗各类胁迫环境的能力、改善作物质量等方面具有积极的作用[3-5]。
镧可以促进小麦和水稻的分蘖，增加单位面积内的千粒重、结实率，从而提高产量[6]；一定浓度的硝酸镧处理还可以缓解盐胁迫对大豆的不良影响，促进其生长，增加干物质的积累，并可使其叶面积增大、抗氧化酶活性增强、降低膜质过氧化产物丙二醛（MDA）的积累等[7] 。
硒对植物本身的生长发育过程起到重要的调节作用。硒可通过提高植物体内抗氧化酶活性的方式增强植物抵抗重金属胁迫环境的能力[8，9]，如硒可降低镉胁迫环境中水稻对镉的吸收和积累，并可抵消由镉诱导的ATP酶活性的变化[10]，硒还可促进镉胁迫环境中萝卜[11]、小白菜[12]的生长，提高其叶片SPAD值，使生物量增加等；硒还可导致镉胁迫下绿豆幼苗可溶性蛋白和脯氨酸的含量变化[13]。
据相关报道，土壤中的硒往往与重金属存在一定的伴生关系[14]。大量的研究表明，硒与一些重金属（如镉、汞等）之间存在拮抗效应，植物从低硒土壤中吸收硒的同时往往会减少对重金属的吸收[15]，而在高浓度硒的土壤中，硒会促进植物对重金属的吸收[16]。由此可以发现，硒与重金属间的关系与植物生长发育间有着重要的联系。
铜是植物生长过程中必不可少的一种微量元素，在植物体内主要参与多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、细胞色素aa3复合体（complex Ⅳ）等生物大分子介导的生理生化代谢过程，对维持植物自身正常的生长发育具有十分重要的意义。而铜作为一种重金属，同时也是一种常见的环境污染物。前人对于小麦[17]、油菜[18]等的研究结果表明，铜胁迫会导致干物质积累量降低、叶绿素合成受阻、可溶性蛋白含量升高、影响抗氧化酶活性（低浓度胁迫活性升高，高浓度胁迫活性降低）、脯氨酸含量升高、膜质过氧化等问题。
目前国内外关于稀土元素或硒元素对缓解作物重金属胁迫的研究多集中于镧或硒对镉、铅等元素胁迫的缓解方面，但是鲜有将二者结合起来研究其复合效应对铜胁迫环境下小麦（Triticum aestivum L.）的影响，尤其是对小麦抗氧化酶和可溶性蛋白含量变化的影响。本试验采用镧浸种与土施亚硒酸盐的方法，研究镧、硒单一作用及两者复合作用对铜胁迫小麦幼苗叶片SOD、POD活性及可溶性蛋白含量的影响，探讨二者的单一及复合作用对小麦铜盐胁迫毒害的缓解效应，以期为重金属污染区的作物种植及土壤修復提供理论参考和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试试剂：硝酸镧（国药集团化学试剂有限公司，AR）、亚硒酸钠（国药集团化学试剂有限公司，CP）、CuSO4·5H2O（国药集团化学试剂有限公司，AR）。供试小麦品种为济麦22、山农28。
1.2 试验设计
试验采用营养液沙基培养法，设硝酸镧浸种、土施亚硒酸钠两个因素处理，其中硝酸镧浸种浓度设定参考史冬平等[19]的试验，分别为0（L0）、30（L30）、50（L50）、100 mg/L（L100）；亚硒酸钠浓度为0（S0）、5（S5）、15（S15）、25 mg/L（S25），使用时以1/2 Hoagland营养液作为溶剂配制。上述试剂中La3+和Se4+离子浓度均以成品计。设置无铜胁迫组作为阴性对照（CK-），单铜胁迫组为阳性对照（CK+）。每品种共计17个处理，详见表1。试验重复3次，每次重复15株。试验中铜盐溶液浓度均以Cu2+计。营养液的配制参考侯福林[20]的配方，设1/2 Hoagland营养液、含100 mg/L CuSO4的1/2 Hoagland营养液。试验过程中营养液均作为基本溶剂，溶解相应量的亚硒酸钠后使用。
1.3 试验方法
选取饱满均匀的小麦种子，用0.1% HgCl2溶液浸泡消毒10 min，然后将种子取出，分别用自来水和蒸馏水冲洗干净，而后按上述浓度设计用不同浓度硝酸镧溶液浸泡种子24 h后，将种子平铺在培养皿内蘸有蒸馏水的滤纸上，置于暗处催芽48 h，待种子露白后移入装有砂子的聚乙烯塑料盆中，置于室内自然生长。待幼苗长至一叶一心期选取长势相近的幼苗，用溶解相应量亚硒酸钠的1/2 Hoagland营养液继续培养，期间每两天浇灌一次营养液，每次40 mL，幼苗长至两叶期时用含有100 mg/L硫酸铜的1/2 Hoagland营养液对所有幼苗进行胁迫处理，期间每两天浇灌一次营养液，每次30 mL，处理5 d后取幼苗进行指标测定。
1.4 指标测定及方法
SOD和POD活性分别采用NBT法和愈创木酚法测定[21]。酶液提取方法如下：称取供试小麦幼苗取材期叶片0.5 g，加5 mL提取液（提取液的配制：取0.0186 g EDTA-Na2、5 g聚乙烯吡咯烷酮，用pH=7.8的磷酸缓冲液稀释至500 mL），加入少量二氧化硅后液氮研磨，在12 000 g、4℃条件下离心20 min，上清液即为酶提取液，置于4℃冰箱中保存备用。数据中酶活力均用比活力（U/g Protein）表示，可溶性蛋白含量由南京建成生物工程研究所的考马斯亮蓝试剂盒测定。
1.5 数据分析
数据采用Microsoft Excel 2007统计整理，使用SPSS 19.0对数据进行统计分析，使用单因素方差分析法分析单因素处理及复合处理指标变化情况，显著性差异检验采用LSD法，变量间相关性检验采用Pearson相关系数法。试验数据均以平均值±标准误差表示。 2 结果与分析
2.1 土施亚硒酸钠对铜胁迫小麦幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的单因素影响
2.1.1 超氧化物歧化酶 从图1可以看出，100 mg/L铜胁迫导致济麦22和山农28幼苗SOD活性降低，相较于清水对照（CK-），济麦22降低了21.8%，差异未达到显著水平；山农28降低了16.4%，差异达到显著水平。随着亚硒酸钠浓度的升高，济麦22和山农28幼苗SOD活性总体呈上升趋势，均高于CK+组，济麦22和山农28均以S25处理SOD活性增强最为显著，其中，济麦22幼苗较CK+处理组显著升高91.7%，山农28幼苗SOD活性显著升高61.5%。济麦22的S5处理SOD活性低于CK+组，表明5 mg/L Se4+与100 mg/L Cu2+产生协同作用，加剧了对SOD活性的抑制作用。
2.1.2 过氧化物酶 通过对比CK-和CK+可以看出，100 mg/L Cu2+胁迫处理使两品种幼苗POD活性降低，其中济麦22降低了41.3%，差异达显著水平；山农28降低了15.6%，差异未达显著水平。亚硒酸钠处理下，济麦22幼苗POD活性的变化趋势与SOD活性变化趋势相似，随着亚硒酸钠浓度升高，POD活性不断升高，不同的是S5处理POD活性高于CK+。S25对济麦22和山农28幼苗POD活性的增强效果最为显著，POD活性分别增加201.0%和175.1%，均达显著水平。
2.1.3 可溶性蛋白 从图1可以看出，济麦22和山农28幼苗CK+组较CK-组可溶性蛋白含量均显著升高，升高幅度分别为29.3%和15.5%。随着亚硒酸钠浓度的升高，两品种可溶性蛋白含量总体上呈下降趋势，均低于CK+组。其中，S25处理对济麦22和山农28幼苗可溶性蛋白含量的降低效果最为显著，下降幅度分别为82.8%和72.3%。
2.2 鑭浸种对铜胁迫小麦幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的单因素影响
2.2.1 超氧化物歧化酶 从图2看出，镧浸种对两品种幼苗SOD活性的影响总体呈现出“低促高抑的影响”，其中，L50处理增强济麦22幼苗SOD活性的幅度最大，为11.0%，达显著水平；L30处理增强山农28幼苗SOD活性的幅度最大，为49.5%，达到显著水平。
2.2.2 过氧化物酶 从图2看出，镧浸种对两品种幼苗POD活性的影响同样呈现“低促高抑”的趋势，济麦22和山农28幼苗POD活性最高的处理均为L50，较CK+分别增加193.1%和244.6%，均达到显著水平。
2.2.3 可溶性蛋白 从图2看出，低浓度镧浸种处理可以降低铜胁迫小麦幼苗可溶性蛋白含量，高浓度镧浸种处理结果则相反。通过对比各处理组的结果可看出，L30处理降低两品种可溶性蛋白含量的效果最明显，其中，济麦22降低13.2%，未达到显著水平；山农28降低33.0%，达到显著水平。
2.3 镧浸种与土施亚硒酸钠对铜胁迫小麦幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的复合影响
2.3.1 超氧化物歧化酶 从图3看出，D1（L30S5）处理济麦22的 SOD活性低于CK+，表明S5水平土施亚硒酸钠与L30水平镧浸种的复合处理加剧了铜胁迫对幼苗SOD活性的抑制。济麦22和山农28幼苗SOD活性最高的处理分别为D8（L100S15）和D3（L30S25），二者较CK+处理分别增加69.5%和100.2%，均达到显著水平。
2.3.2 过氧化物酶 由图3可知，无论是济麦22还是山农28，各复合处理组POD活性均高于CK+，表明各复合处理均不同程度地缓解了铜胁迫对小麦幼苗POD活性的抑制。其中，D3（L30S25）处理增强济麦22幼苗POD活性的效果最为显著，POD活性较CK+增加221.7%；D9（L100S25）处理对山农28幼苗POD活性的提高效果最为显著，较CK+提高263.5%，达到显著水平。通过对比不同镧浸种水平下同一亚硒酸钠水平处理发现，无论是SOD还是POD，随着镧浸种水平的升高，同一水平亚硒酸钠处理的酶活性呈现先升高后降低的趋势，说明镧浸种提高了济麦22和山农28幼苗对亚硒酸钠的耐受能力。
2.3.3 可溶性蛋白 从图3 看出，相较于CK+，除济麦22的D3（L30S25）处理外，两品种复合处理均使可溶性蛋白含量不同程度下降，其中济麦22在同一浸种水平下，随着亚硒酸钠浓度升高，可溶性蛋白含量先逐步下降，亚硒酸钠浓度为25 mg/L时，可溶性蛋白含量开始升高；山农28的复合处理下可溶性蛋白含量的变化趋势不同于济麦22：当镧浸种浓度为30 mg/L和50 mg/L 时，随着亚硒酸钠浓度升高，可溶性蛋白含量呈逐步升高趋势，当镧浸种浓度为100 mg/L 时，5 mg/L和15 mg/L 的亚硒酸钠使可溶性蛋白含量降低，而25 mg/L 的亚硒酸钠则使可溶性蛋白含量升高，这表明济麦
22对镧和硒的敏感度要低于山农28。
2.4 镧浸种和土施亚硒酸钠的双因素分析结果
镧浸种及土施亚硒酸钠对济麦22和山农28铜胁迫小麦幼苗SOD、POD活性及可溶性蛋白含量变化影响的双因素分析结果表明（表2），镧浸种对济麦22幼苗SOD活性及可溶性蛋白含量变化影响的主效应极显著，而对POD活性影响的主效应不显著；土施亚硒酸钠对济麦22两种抗氧化酶及可溶性蛋白含量变化影响的主效应均达极显著水平，而镧和硒的交互效应均达显著水平，这说明镧浸种和土施亚硒酸钠的复合处理可以避免单独镧或硒处理对小麦幼苗主效应不显著的现象。
镧浸种对山农28 SOD活性影响的主效应不显著，对POD活性及可溶性蛋白含量变化的主效应分别达显著和极显著水平。硒对山农28的POD活性变化主效应不显著，对其余两项指标的主效应显著，说明镧和硒影响小麦幼苗叶片抗氧化酶系统的方式不同。
2.5 不同处理下铜胁迫小麦幼苗SOD、POD活性及可溶性蛋白含量间的相关性 从表3可以看出，无论是济麦22还是山农28，各处理下只有SOD活性变化和可溶性蛋白含量变化之间具有极显著的相关性，结合图1和图3的结果，表明各处理下SOD活性变化是可溶性蛋白含量变化引起的，二者呈极显著负相关，即各处理可能并不通过促进SOD合成基因表达，而是通过改变构象或以进行化学修饰的方式提高活性。SOD活性与POD活性以及POD活性与可溶性蛋白含量之间不具相关性。
3 讨论
本试验中，通过对比各指标中CK-与CK+的差异发现，两品种小麦CK+的SOD活性均低于CK-，王蕊[22]和薛盈文[23]的研究也呈现出类似结果，其原因可能是高浓度的Cu2+通过直接抑制SOD活性或者抑制与SOD相关基因的表达过程，使SOD活性下降[24]。另一方面，同一指标在不同品种上的表现不同。各品种CK+指标变化幅度表明济麦22抵抗Cu2+胁迫的能力要弱于山农28，同时相关分析结果也表明，济麦22对于两处理因子的耐受能力也要低于山农28。
本试验结果表明，一定浓度的硝酸镧溶液浸种可以提高小麦幼苗对亚硒酸钠的耐受限度，进而可能提高小麦植株内的有效硒积累；低浓度的La3+或Se4+的单因素效应可提高铜胁迫环境中小麦幼苗抗氧化酶活性，这与史冬平等[19]的研究结果一致。La3+和Se4+的复合处理可以提高小麦幼苗叶片中SOD、POD活性，从而缓解Cu2+对小麦的胁迫效应。穆婷婷等[25]研究表明，外源亚硒酸钠处理可以提高小麦体内GSH含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。Zhao 等[26]研究认为，在植物体内Se4+可与重金属离子形成复合物或使重金属离子的形态改变，以缓解重金属对植物的胁迫。Cobbett等的研究指出，植物体内金属硫蛋白（MT）参与了铜的动态平衡过程[27，28]。对于镧硒复合处理缓解Cu2+对小麦侵害的机制，一种可能的解释为：镧硒复合处理会使小麦中GSH含量升高，大量GSH会被诱导合成植物螯合肽（PCs），PCs与MT协同螯合小麦中积累的Cu2+，以缓解铜胁迫对小麦的侵害[29，30]；另一方面，本研究在小麦中施入Se4+，会造成植株中硒的积累，其与Cu2+直接形成复合物，从而也降低了Cu2+在小麦中的积累量，由于小麦清除过量Cu2+的途径增加，小麦对植物螯合肽、金属硫蛋白等小分子肽和可溶性蛋白的依赖减少，其相关表达量随之下降，胁迫蛋白含量应呈下降趋势。在本试验中，零浓度La3+浸种条件下，随着Se4+处理浓度升高，小麦幼苗可溶性蛋白含量呈下降趋势，且下降幅度与浓度间呈正相关。这也为上述观点提供了证据。
对镧浸种和土施亚硒酸钠的主效应及交互效应的统计分析结果表明，镧浸种和土施亚硒酸钠的复合作用对增强SOD及POD活性具有互补性，并且二者对抗氧化酶活性的影响机理不同。
Xu 等[31]对水稻的研究表明，轻稀土元素Ce （Ⅳ）对于水稻幼苗的生长具有Hormesis效应，即低浓度处理促进水稻幼苗的生长，而高浓度Ce处理会抑制幼苗的生长，Ce浓度高低的变化对SOD、POD等保护酶活性变化的影响较为明显。相似的趋势也出现在郭绍芬[32]的研究中：轻稀土元素La （Ⅲ）对辣根中的过氧化物酶（HRP）呈现出“低促高抑”的Hormesis效应，低浓度La3+处理可以提高HRP的活性，而高浓度的La3+则会抑制HRP活性。其作用机制主要有三个方面：其一，La3+可以与HRP肽链中的酰胺结构键合，使得多肽链中的无序结构减少，进而金属卟啉环的非平面性增加，导致中心离子Fe3+的暴露程度增加，最终使整个HRP分子传递电子的能力增强，使得HRP活性增强；其二，过量La3+存在时，会有La-HRP配合物形成，La3+将HRP中的Ca2+取代，导致HRP活性下降；其三，La-HRP中La3+与HRP酰胺结构中的氮氧元素形成共价键，使整个分子的电子云密度发生变化，最终改变HRP活性。本试验中，对SOD、POD活性及可溶性蛋白含量三者间的相关性分析结果表明，SOD活性变化与可溶性蛋白含量变化间呈极显著负相关，即镧和硒可能是通过改变酶的构象或者通过化学修饰的方式影響SOD活性。SOD和POD同为含金属辅基的酶，故推测在小麦中La3+和Se4+与SOD的作用机制类似La3+与HRP的效应，相关推测还有待进一步验证。
冯璞阳等[33]研究表明，不同类型的土壤中植物对于离子的吸收能力存在差异；谢志明[34]研究表明，植物根际微环境也会对植物吸收离子产生影响。本试验的结果是基于沙土培养的方式得出，在其他类型基质中是否能得出相同结论，仍需进一步的试验加以证实。
本试验中，当以5 mg/L 亚硒酸钠处理时，有多组处理出现酶活性下降的现象，同样的问题也出现在王健等[35]的研究中。具体原因有待进一步探明。
4 结论
（1）100 mg/L 硫酸铜胁迫可使小麦三叶期幼苗SOD和POD活性下降、可溶性蛋白含量升高，抑制小麦幼苗的生长。
（2）两品种小麦对镧浸种及土施亚硒酸钠溶液浓度的敏感性存在差异，山农28抗氧化酶系统抵抗高浓度铜盐胁迫的能力强于济麦22。
（3）镧浸种和土施亚硒酸钠处理对缓解铜胁迫抑制小麦幼苗抗氧化酶活性方面具有互补作用，提高了二者对抗氧化酶活性作用的广谱性。镧浸种处理提高了小麦幼苗对亚硒酸钠的耐受能力。
（4）各水平镧浸种和土施亚硒酸钠处理下，铜胁迫后小麦幼苗超氧化物歧化酶的活性与可溶性蛋白含量呈极显著的负相关，推测镧和硒可能通过改变酶的构象或者通过化学修饰的方式影响SOD活性。
（5）镧浸种缓解济麦22和山农28铜胁迫条件下幼苗抗氧化酶活性抑制的最适浓度范围分别为30～50 mg/L 和30～100 mg/L ；土施亚硒酸钠缓解二者抗氧化酶活性的最适浓度范围分别为15～25 mg/L 和5～25 mg/L ；镧浸种和亚硒酸钠复合处理缓解二者抗氧化酶活性的适宜浓度分别为100 mg/L 镧浸种+5～25 mg/L亚硒酸钠和50 mg/L 镧浸种+5～25 mg/L 亚硒酸钠。 参 考 文 献：
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关键词：小麦；镧；硒；铜胁迫；抗氧化酶；可溶性蛋白
中图分类号：S512.1+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0064-09
Abstract The effects of seed soaking with lanthanum nitrate and watering sodium selenite on the SOD and POD activities and soluble protein content in Jimai 22 and Shannong 28 seedling leaves under copper stress were investigated using the sandculture method. The results showed that 100 mg/L copper sulfate treatment reduced the activities of SOD and POD and increased the content of soluble protein in wheat leaves， which poisoned wheat seedlings. For relieving the inhibition to antioxidase activity in Jimai 22 and Shannong 28 under copper stress， the optimum soaking concentration of lanthanum nitrate were 30～50 mg/L and 30～100 mg/L， and the optimum watering concentration of sodium selenite were 15～25 mg/L and 5～25 mg/L， and the optimum compound treatment conditions were 100 mg/L lanthanum with 5 ～ 25 mg/L sodium selenite and 50 mg/L lanthanum with 5～25 mg/L sodium selenite， respectively. The sensitivity of the two wheat variety to lanthanum soaking and watering sodium selenite solution was different. Shannong 28 had better antioxidase system to resist high concentration copper stress. The single and compound effects of lanthanum seed soaking and watering sodium selenite on the SOD and POD activities of the two wheat variety seedlings under the high concentration of copper stress showed promoting at low concentration and inhibiting at high concentration. Lanthanum soaking treatment improved the tolerance of wheat seedlings to sodium selenite，and their compound effects were complementary on enhancing the SOD and POD activities. These results indicated that lanthanum and selenium might increase the activity by not promoting the expression of SOD synthase genes， but by conformation changing or chemical modification， and the effects of dose followed the Hormesis effect. We concluded that soaking seeds with lanthanum and watering sodium selenite solution at optimum concentration could effectively relieve the oxidative damage to wheat seedlings under copper stress. Keywords Wheat； Lanthanum； Selenium； Copper stress； Antioxidase； Soluble protein
我国稀土资源丰富，无论是种类还是储量均居世界前列[1]。稀土在农业上的应用有着巨大的潜力[2]。研究表明，稀土元素特别是轻稀土元素（如镧、钕等）在促进作物生长、提高其抵抗各类胁迫环境的能力、改善作物质量等方面具有积极的作用[3-5]。
镧可以促进小麦和水稻的分蘖，增加单位面积内的千粒重、结实率，从而提高产量[6]；一定浓度的硝酸镧处理还可以缓解盐胁迫对大豆的不良影响，促进其生长，增加干物质的积累，并可使其叶面积增大、抗氧化酶活性增强、降低膜质过氧化产物丙二醛（MDA）的积累等[7] 。
硒对植物本身的生长发育过程起到重要的调节作用。硒可通过提高植物体内抗氧化酶活性的方式增强植物抵抗重金属胁迫环境的能力[8，9]，如硒可降低镉胁迫环境中水稻对镉的吸收和积累，并可抵消由镉诱导的ATP酶活性的变化[10]，硒还可促进镉胁迫环境中萝卜[11]、小白菜[12]的生长，提高其叶片SPAD值，使生物量增加等；硒还可导致镉胁迫下绿豆幼苗可溶性蛋白和脯氨酸的含量变化[13]。
据相关报道，土壤中的硒往往与重金属存在一定的伴生关系[14]。大量的研究表明，硒与一些重金属（如镉、汞等）之间存在拮抗效应，植物从低硒土壤中吸收硒的同时往往会减少对重金属的吸收[15]，而在高浓度硒的土壤中，硒会促进植物对重金属的吸收[16]。由此可以发现，硒与重金属间的关系与植物生长发育间有着重要的联系。
铜是植物生长过程中必不可少的一种微量元素，在植物体内主要参与多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、细胞色素aa3复合体（complex Ⅳ）等生物大分子介导的生理生化代谢过程，对维持植物自身正常的生长发育具有十分重要的意义。而铜作为一种重金属，同时也是一种常见的环境污染物。前人对于小麦[17]、油菜[18]等的研究结果表明，铜胁迫会导致干物质积累量降低、叶绿素合成受阻、可溶性蛋白含量升高、影响抗氧化酶活性（低浓度胁迫活性升高，高浓度胁迫活性降低）、脯氨酸含量升高、膜质过氧化等问题。
目前国内外关于稀土元素或硒元素对缓解作物重金属胁迫的研究多集中于镧或硒对镉、铅等元素胁迫的缓解方面，但是鲜有将二者结合起来研究其复合效应对铜胁迫环境下小麦（Triticum aestivum L.）的影响，尤其是对小麦抗氧化酶和可溶性蛋白含量变化的影响。本试验采用镧浸种与土施亚硒酸盐的方法，研究镧、硒单一作用及两者复合作用对铜胁迫小麦幼苗叶片SOD、POD活性及可溶性蛋白含量的影响，探讨二者的单一及复合作用对小麦铜盐胁迫毒害的缓解效应，以期为重金属污染区的作物种植及土壤修復提供理论参考和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试试剂：硝酸镧（国药集团化学试剂有限公司，AR）、亚硒酸钠（国药集团化学试剂有限公司，CP）、CuSO4·5H2O（国药集团化学试剂有限公司，AR）。供试小麦品种为济麦22、山农28。
1.2 试验设计
试验采用营养液沙基培养法，设硝酸镧浸种、土施亚硒酸钠两个因素处理，其中硝酸镧浸种浓度设定参考史冬平等[19]的试验，分别为0（L0）、30（L30）、50（L50）、100 mg/L（L100）；亚硒酸钠浓度为0（S0）、5（S5）、15（S15）、25 mg/L（S25），使用时以1/2 Hoagland营养液作为溶剂配制。上述试剂中La3+和Se4+离子浓度均以成品计。设置无铜胁迫组作为阴性对照（CK-），单铜胁迫组为阳性对照（CK+）。每品种共计17个处理，详见表1。试验重复3次，每次重复15株。试验中铜盐溶液浓度均以Cu2+计。营养液的配制参考侯福林[20]的配方，设1/2 Hoagland营养液、含100 mg/L CuSO4的1/2 Hoagland营养液。试验过程中营养液均作为基本溶剂，溶解相应量的亚硒酸钠后使用。
1.3 试验方法
选取饱满均匀的小麦种子，用0.1% HgCl2溶液浸泡消毒10 min，然后将种子取出，分别用自来水和蒸馏水冲洗干净，而后按上述浓度设计用不同浓度硝酸镧溶液浸泡种子24 h后，将种子平铺在培养皿内蘸有蒸馏水的滤纸上，置于暗处催芽48 h，待种子露白后移入装有砂子的聚乙烯塑料盆中，置于室内自然生长。待幼苗长至一叶一心期选取长势相近的幼苗，用溶解相应量亚硒酸钠的1/2 Hoagland营养液继续培养，期间每两天浇灌一次营养液，每次40 mL，幼苗长至两叶期时用含有100 mg/L硫酸铜的1/2 Hoagland营养液对所有幼苗进行胁迫处理，期间每两天浇灌一次营养液，每次30 mL，处理5 d后取幼苗进行指标测定。
1.4 指标测定及方法
SOD和POD活性分别采用NBT法和愈创木酚法测定[21]。酶液提取方法如下：称取供试小麦幼苗取材期叶片0.5 g，加5 mL提取液（提取液的配制：取0.0186 g EDTA-Na2、5 g聚乙烯吡咯烷酮，用pH=7.8的磷酸缓冲液稀释至500 mL），加入少量二氧化硅后液氮研磨，在12 000 g、4℃条件下离心20 min，上清液即为酶提取液，置于4℃冰箱中保存备用。数据中酶活力均用比活力（U/g Protein）表示，可溶性蛋白含量由南京建成生物工程研究所的考马斯亮蓝试剂盒测定。
1.5 数据分析
数据采用Microsoft Excel 2007统计整理，使用SPSS 19.0对数据进行统计分析，使用单因素方差分析法分析单因素处理及复合处理指标变化情况，显著性差异检验采用LSD法，变量间相关性检验采用Pearson相关系数法。试验数据均以平均值±标准误差表示。 2 结果与分析
2.1 土施亚硒酸钠对铜胁迫小麦幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的单因素影响
2.1.1 超氧化物歧化酶 从图1可以看出，100 mg/L铜胁迫导致济麦22和山农28幼苗SOD活性降低，相较于清水对照（CK-），济麦22降低了21.8%，差异未达到显著水平；山农28降低了16.4%，差异达到显著水平。随着亚硒酸钠浓度的升高，济麦22和山农28幼苗SOD活性总体呈上升趋势，均高于CK+组，济麦22和山农28均以S25处理SOD活性增强最为显著，其中，济麦22幼苗较CK+处理组显著升高91.7%，山农28幼苗SOD活性显著升高61.5%。济麦22的S5处理SOD活性低于CK+组，表明5 mg/L Se4+与100 mg/L Cu2+产生协同作用，加剧了对SOD活性的抑制作用。
2.1.2 过氧化物酶 通过对比CK-和CK+可以看出，100 mg/L Cu2+胁迫处理使两品种幼苗POD活性降低，其中济麦22降低了41.3%，差异达显著水平；山农28降低了15.6%，差异未达显著水平。亚硒酸钠处理下，济麦22幼苗POD活性的变化趋势与SOD活性变化趋势相似，随着亚硒酸钠浓度升高，POD活性不断升高，不同的是S5处理POD活性高于CK+。S25对济麦22和山农28幼苗POD活性的增强效果最为显著，POD活性分别增加201.0%和175.1%，均达显著水平。
2.1.3 可溶性蛋白 从图1可以看出，济麦22和山农28幼苗CK+组较CK-组可溶性蛋白含量均显著升高，升高幅度分别为29.3%和15.5%。随着亚硒酸钠浓度的升高，两品种可溶性蛋白含量总体上呈下降趋势，均低于CK+组。其中，S25处理对济麦22和山农28幼苗可溶性蛋白含量的降低效果最为显著，下降幅度分别为82.8%和72.3%。
2.2 鑭浸种对铜胁迫小麦幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的单因素影响
2.2.1 超氧化物歧化酶 从图2看出，镧浸种对两品种幼苗SOD活性的影响总体呈现出“低促高抑的影响”，其中，L50处理增强济麦22幼苗SOD活性的幅度最大，为11.0%，达显著水平；L30处理增强山农28幼苗SOD活性的幅度最大，为49.5%，达到显著水平。
2.2.2 过氧化物酶 从图2看出，镧浸种对两品种幼苗POD活性的影响同样呈现“低促高抑”的趋势，济麦22和山农28幼苗POD活性最高的处理均为L50，较CK+分别增加193.1%和244.6%，均达到显著水平。
2.2.3 可溶性蛋白 从图2看出，低浓度镧浸种处理可以降低铜胁迫小麦幼苗可溶性蛋白含量，高浓度镧浸种处理结果则相反。通过对比各处理组的结果可看出，L30处理降低两品种可溶性蛋白含量的效果最明显，其中，济麦22降低13.2%，未达到显著水平；山农28降低33.0%，达到显著水平。
2.3 镧浸种与土施亚硒酸钠对铜胁迫小麦幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白含量的复合影响
2.3.1 超氧化物歧化酶 从图3看出，D1（L30S5）处理济麦22的 SOD活性低于CK+，表明S5水平土施亚硒酸钠与L30水平镧浸种的复合处理加剧了铜胁迫对幼苗SOD活性的抑制。济麦22和山农28幼苗SOD活性最高的处理分别为D8（L100S15）和D3（L30S25），二者较CK+处理分别增加69.5%和100.2%，均达到显著水平。
2.3.2 过氧化物酶 由图3可知，无论是济麦22还是山农28，各复合处理组POD活性均高于CK+，表明各复合处理均不同程度地缓解了铜胁迫对小麦幼苗POD活性的抑制。其中，D3（L30S25）处理增强济麦22幼苗POD活性的效果最为显著，POD活性较CK+增加221.7%；D9（L100S25）处理对山农28幼苗POD活性的提高效果最为显著，较CK+提高263.5%，达到显著水平。通过对比不同镧浸种水平下同一亚硒酸钠水平处理发现，无论是SOD还是POD，随着镧浸种水平的升高，同一水平亚硒酸钠处理的酶活性呈现先升高后降低的趋势，说明镧浸种提高了济麦22和山农28幼苗对亚硒酸钠的耐受能力。
2.3.3 可溶性蛋白 从图3 看出，相较于CK+，除济麦22的D3（L30S25）处理外，两品种复合处理均使可溶性蛋白含量不同程度下降，其中济麦22在同一浸种水平下，随着亚硒酸钠浓度升高，可溶性蛋白含量先逐步下降，亚硒酸钠浓度为25 mg/L时，可溶性蛋白含量开始升高；山农28的复合处理下可溶性蛋白含量的变化趋势不同于济麦22：当镧浸种浓度为30 mg/L和50 mg/L 时，随着亚硒酸钠浓度升高，可溶性蛋白含量呈逐步升高趋势，当镧浸种浓度为100 mg/L 时，5 mg/L和15 mg/L 的亚硒酸钠使可溶性蛋白含量降低，而25 mg/L 的亚硒酸钠则使可溶性蛋白含量升高，这表明济麦
22对镧和硒的敏感度要低于山农28。
2.4 镧浸种和土施亚硒酸钠的双因素分析结果
镧浸种及土施亚硒酸钠对济麦22和山农28铜胁迫小麦幼苗SOD、POD活性及可溶性蛋白含量变化影响的双因素分析结果表明（表2），镧浸种对济麦22幼苗SOD活性及可溶性蛋白含量变化影响的主效应极显著，而对POD活性影响的主效应不显著；土施亚硒酸钠对济麦22两种抗氧化酶及可溶性蛋白含量变化影响的主效应均达极显著水平，而镧和硒的交互效应均达显著水平，这说明镧浸种和土施亚硒酸钠的复合处理可以避免单独镧或硒处理对小麦幼苗主效应不显著的现象。
镧浸种对山农28 SOD活性影响的主效应不显著，对POD活性及可溶性蛋白含量变化的主效应分别达显著和极显著水平。硒对山农28的POD活性变化主效应不显著，对其余两项指标的主效应显著，说明镧和硒影响小麦幼苗叶片抗氧化酶系统的方式不同。
2.5 不同处理下铜胁迫小麦幼苗SOD、POD活性及可溶性蛋白含量间的相关性 从表3可以看出，无论是济麦22还是山农28，各处理下只有SOD活性变化和可溶性蛋白含量变化之间具有极显著的相关性，结合图1和图3的结果，表明各处理下SOD活性变化是可溶性蛋白含量变化引起的，二者呈极显著负相关，即各处理可能并不通过促进SOD合成基因表达，而是通过改变构象或以进行化学修饰的方式提高活性。SOD活性与POD活性以及POD活性与可溶性蛋白含量之间不具相关性。
3 讨论
本试验中，通过对比各指标中CK-与CK+的差异发现，两品种小麦CK+的SOD活性均低于CK-，王蕊[22]和薛盈文[23]的研究也呈现出类似结果，其原因可能是高浓度的Cu2+通过直接抑制SOD活性或者抑制与SOD相关基因的表达过程，使SOD活性下降[24]。另一方面，同一指标在不同品种上的表现不同。各品种CK+指标变化幅度表明济麦22抵抗Cu2+胁迫的能力要弱于山农28，同时相关分析结果也表明，济麦22对于两处理因子的耐受能力也要低于山农28。
本试验结果表明，一定浓度的硝酸镧溶液浸种可以提高小麦幼苗对亚硒酸钠的耐受限度，进而可能提高小麦植株内的有效硒积累；低浓度的La3+或Se4+的单因素效应可提高铜胁迫环境中小麦幼苗抗氧化酶活性，这与史冬平等[19]的研究结果一致。La3+和Se4+的复合处理可以提高小麦幼苗叶片中SOD、POD活性，从而缓解Cu2+对小麦的胁迫效应。穆婷婷等[25]研究表明，外源亚硒酸钠处理可以提高小麦体内GSH含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。Zhao 等[26]研究认为，在植物体内Se4+可与重金属离子形成复合物或使重金属离子的形态改变，以缓解重金属对植物的胁迫。Cobbett等的研究指出，植物体内金属硫蛋白（MT）参与了铜的动态平衡过程[27，28]。对于镧硒复合处理缓解Cu2+对小麦侵害的机制，一种可能的解释为：镧硒复合处理会使小麦中GSH含量升高，大量GSH会被诱导合成植物螯合肽（PCs），PCs与MT协同螯合小麦中积累的Cu2+，以缓解铜胁迫对小麦的侵害[29，30]；另一方面，本研究在小麦中施入Se4+，会造成植株中硒的积累，其与Cu2+直接形成复合物，从而也降低了Cu2+在小麦中的积累量，由于小麦清除过量Cu2+的途径增加，小麦对植物螯合肽、金属硫蛋白等小分子肽和可溶性蛋白的依赖减少，其相关表达量随之下降，胁迫蛋白含量应呈下降趋势。在本试验中，零浓度La3+浸种条件下，随着Se4+处理浓度升高，小麦幼苗可溶性蛋白含量呈下降趋势，且下降幅度与浓度间呈正相关。这也为上述观点提供了证据。
对镧浸种和土施亚硒酸钠的主效应及交互效应的统计分析结果表明，镧浸种和土施亚硒酸钠的复合作用对增强SOD及POD活性具有互补性，并且二者对抗氧化酶活性的影响机理不同。
Xu 等[31]对水稻的研究表明，轻稀土元素Ce （Ⅳ）对于水稻幼苗的生长具有Hormesis效应，即低浓度处理促进水稻幼苗的生长，而高浓度Ce处理会抑制幼苗的生长，Ce浓度高低的变化对SOD、POD等保护酶活性变化的影响较为明显。相似的趋势也出现在郭绍芬[32]的研究中：轻稀土元素La （Ⅲ）对辣根中的过氧化物酶（HRP）呈现出“低促高抑”的Hormesis效应，低浓度La3+处理可以提高HRP的活性，而高浓度的La3+则会抑制HRP活性。其作用机制主要有三个方面：其一，La3+可以与HRP肽链中的酰胺结构键合，使得多肽链中的无序结构减少，进而金属卟啉环的非平面性增加，导致中心离子Fe3+的暴露程度增加，最终使整个HRP分子传递电子的能力增强，使得HRP活性增强；其二，过量La3+存在时，会有La-HRP配合物形成，La3+将HRP中的Ca2+取代，导致HRP活性下降；其三，La-HRP中La3+与HRP酰胺结构中的氮氧元素形成共价键，使整个分子的电子云密度发生变化，最终改变HRP活性。本试验中，对SOD、POD活性及可溶性蛋白含量三者间的相关性分析结果表明，SOD活性变化与可溶性蛋白含量变化间呈极显著负相关，即镧和硒可能是通过改变酶的构象或者通过化学修饰的方式影響SOD活性。SOD和POD同为含金属辅基的酶，故推测在小麦中La3+和Se4+与SOD的作用机制类似La3+与HRP的效应，相关推测还有待进一步验证。
冯璞阳等[33]研究表明，不同类型的土壤中植物对于离子的吸收能力存在差异；谢志明[34]研究表明，植物根际微环境也会对植物吸收离子产生影响。本试验的结果是基于沙土培养的方式得出，在其他类型基质中是否能得出相同结论，仍需进一步的试验加以证实。
本试验中，当以5 mg/L 亚硒酸钠处理时，有多组处理出现酶活性下降的现象，同样的问题也出现在王健等[35]的研究中。具体原因有待进一步探明。
4 结论
（1）100 mg/L 硫酸铜胁迫可使小麦三叶期幼苗SOD和POD活性下降、可溶性蛋白含量升高，抑制小麦幼苗的生长。
（2）两品种小麦对镧浸种及土施亚硒酸钠溶液浓度的敏感性存在差异，山农28抗氧化酶系统抵抗高浓度铜盐胁迫的能力强于济麦22。
（3）镧浸种和土施亚硒酸钠处理对缓解铜胁迫抑制小麦幼苗抗氧化酶活性方面具有互补作用，提高了二者对抗氧化酶活性作用的广谱性。镧浸种处理提高了小麦幼苗对亚硒酸钠的耐受能力。
（4）各水平镧浸种和土施亚硒酸钠处理下，铜胁迫后小麦幼苗超氧化物歧化酶的活性与可溶性蛋白含量呈极显著的负相关，推测镧和硒可能通过改变酶的构象或者通过化学修饰的方式影响SOD活性。
（5）镧浸种缓解济麦22和山农28铜胁迫条件下幼苗抗氧化酶活性抑制的最适浓度范围分别为30～50 mg/L 和30～100 mg/L ；土施亚硒酸钠缓解二者抗氧化酶活性的最适浓度范围分别为15～25 mg/L 和5～25 mg/L ；镧浸种和亚硒酸钠复合处理缓解二者抗氧化酶活性的适宜浓度分别为100 mg/L 镧浸种+5～25 mg/L亚硒酸钠和50 mg/L 镧浸种+5～25 mg/L 亚硒酸钠。 参 考 文 献：
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