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摘 要 为了给“不知火”柑橘的综合开发利用提供一定的理论依据，分别采用酸水解法、水蒸气蒸馏法、溶剂提取法对四川乐山、眉山、成都3个地区引种栽培的“不知火”柑橘皮中果胶、精油、黄酮的含量进行测定。测量结果为乐山产“不知火”橘皮内的果胶得率为18.13%、精油得率3.50%、黄酮含量为0.45 mg·g-1，眉山产“不知火”橘皮中果胶得率为17.31%、精油得率2.00%、黄酮含量为0.28 mg·g-1，成都产“不知火”橘皮中果胶得率为9.43%、精油得率1.75%、黄酮含量为0.24 mg·g-1。
关键词 “不知火”柑橘皮;果胶;精油;黄酮
中图分类号：S666 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.28.006
“不知火”柑橘又称“凸橘”“丑橘”，是日本农水省园艺试验场于1972年以“清见”与“中野3号”椪柑杂交育成[1]，2000年引入我国四川种植，主要集中在成都、眉山、乐山等地栽培。目前，“不知火”柑橘主要用于鲜果销售和果肉榨汁。柑橘皮富含黄酮类、维生素、香精油、果胶、纤维素、色素和橙皮苷等多种有效成分，但有效利用不足[2-3]。1）橘皮里的果胶非常稳定，具有增稠和胶凝特性[4]，可以用作胶凝剂、增稠剂、乳化剂和佐剂[5]，同时具有抗菌消炎和抗癌等作用。2）橘皮含有非常丰富的精油成分，是提取精油的原料之一，以D-柠檬烯为主，精油不仅用途广泛，而且具有抑菌杀菌、抗氧化活性和抗肿瘤细胞活性等作用[6]。在食物和动物饲料中加入柑橘皮精油，既可杀死食源性病原体，又可防止食品变质[7]。3）橘皮中的类黄酮和酚酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗心血管、解毒护肝和抑制癌细胞生长等药理作用[8-9]。
“不知火”橘皮具有果皮厚实的特点，经测定，橘皮可占整果重量30%。目前，尚未有关“不知火”橘皮中有效成分的研究报道，故本研究基于对柑橘皮活性成分的已有研究，分别通过酸水解法、水蒸气蒸馏法和溶剂萃取法测定四川乐山、眉山、成都等地“不知火”柑橘皮的果胶、精油和黄酮的含量，为“不知火”开发运用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
“不知火”样品分别购于四川省乐山市井研县、眉山市丹棱县、成都市蒲江县，购得后保存在贴好标签的密封袋中，放置在4 ℃條件的冰箱中保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 果胶的制备（酸水解法）
1.2.1.1 原料预处理
称取预先制备的“不知火”干燥果皮样品各16 g，加入240 mL的水，并置于90 ℃的水浴中5～10 min，使酶失活以防止果胶分解，将其用纱布过滤，取出果皮，用水洗涤并切成3～5 mm的大小。然后用50～60 ℃的温水冲洗果皮，每次冲洗后，用纱布挤压果皮，重复上述步骤，漂洗。至果皮无色无异味即可[9-10]。
1.2.1.2 酸水解提取果胶
将预处理过的果皮颗入烧杯中，加入0.2 mol·L-1盐酸浸泡，将溶液的pH值调节在2.0～2.5，并置于90 ℃数显恒温水浴中40 min。期间继续用玻璃棒搅拌。趁热用布氏漏斗过滤，将滤渣用清水洗涤直至粘度消失，然后将滤液和洗涤液合并以获得水溶性果胶提取物。
1.2.1.3 脱色
向所获滤液中加入了少量活性炭，并在80 ℃下加热20 min以使其脱色和除味。
1.2.1.4 沉淀
用冰袋围住盛有过滤后所得溶液的烧杯，迅速冷却，用6 mol·L-1冷稀氨水将pH值调至3～4，并用玻璃棒连续搅拌。然后缓慢加入原始滤液体积的1.5倍的95%的乙醇溶液，静置至絮凝物产生时，用尼龙布过滤以获得湿果胶。
1.2.1.5 过滤、洗涤、干燥
向湿果胶中加入30 mL的无水乙醇洗涤，过滤并用尼龙布挤压。将脱水的果胶放入表面皿中，摊开放入60～70 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥，然后压碎成果胶。
1.2.1.6 果胶产率计算
果胶的产率根据等式（1）计算。
W=（m1/m2）×100% （1）
公式（1）中：W—果胶得率，%;m1—成品果胶质量，g;m2—果皮粉质量，g。
1.2.2 精油提取方法（水蒸气蒸馏法）
1.2.2.1 原料预处理
使用粉碎机将干燥后的“不知火”柑橘皮样品粉碎至粉末状，各称取干果皮20 g放置于500 mL蒸馏瓶中，加入蒸馏水200 mL作为提取剂[物料、液体的比例为1∶10 （g·mL-1）]，并加入NaCl 0.3 g作为提取助剂，利用水蒸气蒸馏装置提取2.5 h后收集馏出液[11-12]。经静置、离心后得精油成品。若收集到的精油中含有少许水分，可加入适当的无水硫酸钠脱水后称量，再计算精油得率。
1.2.2.2 精油出油率计算
柑橘出油率采用直接称重法计算，计算公式见公式（2）。
出油率（%）=精油产品质量（g）/“不知火”果皮干重（g）×100% （2）
1.2.3 黄酮提取方法（溶剂提取法）
1.2.3.1 芦丁标准曲线
取0.1 g·mL-1的芦丁标准溶液，然后在6个10 mL带有塞子的试管中，分别对应加入芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。在每个试管中分别加入30%乙醇5 mL和0.3 mL的5% NaNO2溶液，摇匀静置6 min。然后再加入0.3 mL10%的Al2（SO4）3溶液并放置6 min。加入4%NaOH溶液4 mL，摇匀后用蒸馏水定容至10 mL，静置20 min。510 nm测出芦丁标准溶剂溶液的吸光度，重复3次[10，13-14]，实验结果见表1。根据实验数据求出实验的回归方程和相关系数，所得结果如图1 所示。实验中获得的标准回归方程见公式（3）。 Y=40.984X+0.016 2 （3）
公式（3）中：Y—吸光度，A;X—標准溶液浓度，mg·mL-1;相关系数R2为0.999 6。
回归方程见公式（4）。
Y=40.984X+0.016 2（R2=0.999 6） （4）
公式（4）中：Y—吸光度（A）;X—标准溶液浓度，mg·mL-1。
1.2.3.2 黄酮样品制备
称取干燥后“不知火”柑橘皮样品粉末各1 g，加入70%乙醇25 mL，分别置于100 mL烧瓶中，并固定在恒温水浴锅（70 ℃）中2 h。震荡后取抽滤，留下第1次滤液。滤渣进行第2次浸提，取出过滤，合并2次滤液，再次加入70%乙醇并至100 mL，将所得的溶液放于4 ℃条件下保存备用。
1.2.3.3 样品黄酮测定
准确量取各“不知火”黄酮样品溶液5 mL，分别加入0.3 mL的5%NaNO2摇动6 min，然后加入0.3 mL的10%的Al（NO3）3，混匀后放置6 min，然后再加入4%NaOH（现配）溶液4 mL，最后加入蒸馏水定容至10 mL，震荡后静置20 min。在510 nm处测量吸光度，根据标准曲线计算样品中的类黄酮含量，并重复实验3次取平均值。
1.2.3.4 黄酮含量计算
黄酮含量计算公式见公式（5）。
C=（A-0.0162）/40.984 公式（5）
公式（5）中：A—样品的吸光度;C—提取物中黄酮的浓度。
E=C×V×n/m 公式（6）
公式（6）中：E—总黄酮的含量，mg·g-1;C—提取物中黄酮的浓度，g·mL-1;V—体积，mL;n—稀释倍数;m—所用样品的重量，g[15]。
2 结果与分析
2.1 “不知火”柑橘皮中果胶得率测定结果
根据测验方法进行3次重复实验，测得“不知火”橘皮果胶含量见表2，其中乐山“不知火”橘皮果胶得率为18.13%，眉山“不知火”橘皮果胶得率为17.31%，成都“不知火”橘皮果胶得率为9.43%，平均果胶得率为14.96%。
2.2 “不知火”柑橘皮中精油得率测定结果
根据测验方法进行3次重复实验，测得“不知火”橘皮精油含量见表3，其中乐山“不知火”橘皮精油得率为3.50%，眉山“不知火”橘皮精油得率为2.00%，成都“不知火”橘皮精油得率为1.75%，平均橘皮精油得率为2.42%。
2.3 “不知火”柑橘皮中黄酮测定结果
根据测验方法进行3次重复行实验，测得“不知火”橘皮黄酮含量，其中乐山“不知火”橘皮黄酮含量为0.45 mg·g-1，眉山“不知火”橘皮黄酮含量为0.28 mg·g-1，成都“不知火”橘皮黄酮含量为0.24 mg·g-1，平均黄酮含量为0.32 mg·g-1。
3 小结与讨论
“不知火”柑橘因其奇特的果实外形，脆甜带点微酸的口感，个性化的外观和别具一格的风味成为其销售的亮点。又因其具有丰产性及与“椪柑”相当的耐寒性在四川省得到大面积种植[16-17]，大范围的种植需要加大对副产物柑橘皮渣的利用，目前对柑橘果皮的处理，主要有晒干入药和废弃，而并没有物尽其用。多个研究表明，果胶、精油、黄酮等化合物广泛存在于柑橘皮渣中且具有极大的开发利用价值[5]。果胶是一种植物多聚糖，是细胞壁的主要成分之一，作为天然的食品加入剂，它在食品、制药行业中扮演着不可替代的角色。此外，橘皮中所含的黄酮类化合物是许多中草药的有效成分，具有降低血糖血脂、抗氧化、调理肠道微生物和消化酶活性以此促进消化等多种生理功能，这些性质赋予它极高的食用和药用价值。为此，各国政府和医药、食品等行业都对它给予高度重视和热切关注。
本研究结果显示，乐山、眉山、成都3个地区的“不知火”柑橘皮中均含有丰富的果胶、精油和黄酮，但各有效成分含量因产地不同存在差异。在果胶得率方面，乐山和眉山果胶得率接近，成都的果胶得率最低，平均果胶得率为14.96%，造成差异的原因可能与气候、地势、土质及栽培方式不同有关，同时总体果胶得率较低[10]，可能因为“不知火”柑橘皮果胶提取工艺有待进一步优化。在精油提取方面，由于采取的是水蒸气蒸馏法而非压榨法，使得实验所得精油为透明澄清液体，还夹杂淡淡的橘皮清香，这表明通过蒸汽蒸馏提取的精油具有良好的外观、颜色和气味，且精油的产率也相对较高，一般柑橘皮精油出油率为1.2%～1.6%，而由“不知火”柑橘皮提取出的精油高达2.42%。本实验采取溶剂提取法提取柑橘皮总黄酮，与超声波辅助法、碱法提取等相比[18]，其方法简单，设备要求低，是目前常用的柑橘皮黄酮提取方法，本实验测得乐山“不知火”橘皮黄酮含量为0.45 mg·g-1，眉山“不知火”橘皮黄酮含量为0.28 mg·g-1，成都“不知火”橘皮黄酮含量为0.24 mg·g-1，平均黄酮含量为0.32 mg·g-1，存在一定的地区差异性。
全面利用柑橘各个部位，特别是原本作为废弃物的果皮渣，这不仅可以提高经济效益，还可以促进资源循环利用，为环境保护做了相应贡献，减少污染，因而具有良好的市场开发前景。本研究为综合开发和利用“不知火”柑橘皮的有效成分，获得更大的经济效益和社会效益提供了理论基础。
参考文献：
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[6] 郝婧玮，索莲宦，杨斯棋，等.橘皮与橙皮精油抑菌、抗氧化、抗肿瘤活性研究[J].中医药学报，2019，47（4）：37-41.
[7] 段亮亮，商晋，张维敏，等.柑橘皮精油成分、抑菌作用及食品应用[J].现代食品，2019（5）：1-4，10.
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（责任编辑：敬廷桃）
关键词 “不知火”柑橘皮;果胶;精油;黄酮
中图分类号：S666 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.28.006
“不知火”柑橘又称“凸橘”“丑橘”，是日本农水省园艺试验场于1972年以“清见”与“中野3号”椪柑杂交育成[1]，2000年引入我国四川种植，主要集中在成都、眉山、乐山等地栽培。目前，“不知火”柑橘主要用于鲜果销售和果肉榨汁。柑橘皮富含黄酮类、维生素、香精油、果胶、纤维素、色素和橙皮苷等多种有效成分，但有效利用不足[2-3]。1）橘皮里的果胶非常稳定，具有增稠和胶凝特性[4]，可以用作胶凝剂、增稠剂、乳化剂和佐剂[5]，同时具有抗菌消炎和抗癌等作用。2）橘皮含有非常丰富的精油成分，是提取精油的原料之一，以D-柠檬烯为主，精油不仅用途广泛，而且具有抑菌杀菌、抗氧化活性和抗肿瘤细胞活性等作用[6]。在食物和动物饲料中加入柑橘皮精油，既可杀死食源性病原体，又可防止食品变质[7]。3）橘皮中的类黄酮和酚酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗心血管、解毒护肝和抑制癌细胞生长等药理作用[8-9]。
“不知火”橘皮具有果皮厚实的特点，经测定，橘皮可占整果重量30%。目前，尚未有关“不知火”橘皮中有效成分的研究报道，故本研究基于对柑橘皮活性成分的已有研究，分别通过酸水解法、水蒸气蒸馏法和溶剂萃取法测定四川乐山、眉山、成都等地“不知火”柑橘皮的果胶、精油和黄酮的含量，为“不知火”开发运用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
“不知火”样品分别购于四川省乐山市井研县、眉山市丹棱县、成都市蒲江县，购得后保存在贴好标签的密封袋中，放置在4 ℃條件的冰箱中保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 果胶的制备（酸水解法）
1.2.1.1 原料预处理
称取预先制备的“不知火”干燥果皮样品各16 g，加入240 mL的水，并置于90 ℃的水浴中5～10 min，使酶失活以防止果胶分解，将其用纱布过滤，取出果皮，用水洗涤并切成3～5 mm的大小。然后用50～60 ℃的温水冲洗果皮，每次冲洗后，用纱布挤压果皮，重复上述步骤，漂洗。至果皮无色无异味即可[9-10]。
1.2.1.2 酸水解提取果胶
将预处理过的果皮颗入烧杯中，加入0.2 mol·L-1盐酸浸泡，将溶液的pH值调节在2.0～2.5，并置于90 ℃数显恒温水浴中40 min。期间继续用玻璃棒搅拌。趁热用布氏漏斗过滤，将滤渣用清水洗涤直至粘度消失，然后将滤液和洗涤液合并以获得水溶性果胶提取物。
1.2.1.3 脱色
向所获滤液中加入了少量活性炭，并在80 ℃下加热20 min以使其脱色和除味。
1.2.1.4 沉淀
用冰袋围住盛有过滤后所得溶液的烧杯，迅速冷却，用6 mol·L-1冷稀氨水将pH值调至3～4，并用玻璃棒连续搅拌。然后缓慢加入原始滤液体积的1.5倍的95%的乙醇溶液，静置至絮凝物产生时，用尼龙布过滤以获得湿果胶。
1.2.1.5 过滤、洗涤、干燥
向湿果胶中加入30 mL的无水乙醇洗涤，过滤并用尼龙布挤压。将脱水的果胶放入表面皿中，摊开放入60～70 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥，然后压碎成果胶。
1.2.1.6 果胶产率计算
果胶的产率根据等式（1）计算。
W=（m1/m2）×100% （1）
公式（1）中：W—果胶得率，%;m1—成品果胶质量，g;m2—果皮粉质量，g。
1.2.2 精油提取方法（水蒸气蒸馏法）
1.2.2.1 原料预处理
使用粉碎机将干燥后的“不知火”柑橘皮样品粉碎至粉末状，各称取干果皮20 g放置于500 mL蒸馏瓶中，加入蒸馏水200 mL作为提取剂[物料、液体的比例为1∶10 （g·mL-1）]，并加入NaCl 0.3 g作为提取助剂，利用水蒸气蒸馏装置提取2.5 h后收集馏出液[11-12]。经静置、离心后得精油成品。若收集到的精油中含有少许水分，可加入适当的无水硫酸钠脱水后称量，再计算精油得率。
1.2.2.2 精油出油率计算
柑橘出油率采用直接称重法计算，计算公式见公式（2）。
出油率（%）=精油产品质量（g）/“不知火”果皮干重（g）×100% （2）
1.2.3 黄酮提取方法（溶剂提取法）
1.2.3.1 芦丁标准曲线
取0.1 g·mL-1的芦丁标准溶液，然后在6个10 mL带有塞子的试管中，分别对应加入芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。在每个试管中分别加入30%乙醇5 mL和0.3 mL的5% NaNO2溶液，摇匀静置6 min。然后再加入0.3 mL10%的Al2（SO4）3溶液并放置6 min。加入4%NaOH溶液4 mL，摇匀后用蒸馏水定容至10 mL，静置20 min。510 nm测出芦丁标准溶剂溶液的吸光度，重复3次[10，13-14]，实验结果见表1。根据实验数据求出实验的回归方程和相关系数，所得结果如图1 所示。实验中获得的标准回归方程见公式（3）。 Y=40.984X+0.016 2 （3）
公式（3）中：Y—吸光度，A;X—標准溶液浓度，mg·mL-1;相关系数R2为0.999 6。
回归方程见公式（4）。
Y=40.984X+0.016 2（R2=0.999 6） （4）
公式（4）中：Y—吸光度（A）;X—标准溶液浓度，mg·mL-1。
1.2.3.2 黄酮样品制备
称取干燥后“不知火”柑橘皮样品粉末各1 g，加入70%乙醇25 mL，分别置于100 mL烧瓶中，并固定在恒温水浴锅（70 ℃）中2 h。震荡后取抽滤，留下第1次滤液。滤渣进行第2次浸提，取出过滤，合并2次滤液，再次加入70%乙醇并至100 mL，将所得的溶液放于4 ℃条件下保存备用。
1.2.3.3 样品黄酮测定
准确量取各“不知火”黄酮样品溶液5 mL，分别加入0.3 mL的5%NaNO2摇动6 min，然后加入0.3 mL的10%的Al（NO3）3，混匀后放置6 min，然后再加入4%NaOH（现配）溶液4 mL，最后加入蒸馏水定容至10 mL，震荡后静置20 min。在510 nm处测量吸光度，根据标准曲线计算样品中的类黄酮含量，并重复实验3次取平均值。
1.2.3.4 黄酮含量计算
黄酮含量计算公式见公式（5）。
C=（A-0.0162）/40.984 公式（5）
公式（5）中：A—样品的吸光度;C—提取物中黄酮的浓度。
E=C×V×n/m 公式（6）
公式（6）中：E—总黄酮的含量，mg·g-1;C—提取物中黄酮的浓度，g·mL-1;V—体积，mL;n—稀释倍数;m—所用样品的重量，g[15]。
2 结果与分析
2.1 “不知火”柑橘皮中果胶得率测定结果
根据测验方法进行3次重复实验，测得“不知火”橘皮果胶含量见表2，其中乐山“不知火”橘皮果胶得率为18.13%，眉山“不知火”橘皮果胶得率为17.31%，成都“不知火”橘皮果胶得率为9.43%，平均果胶得率为14.96%。
2.2 “不知火”柑橘皮中精油得率测定结果
根据测验方法进行3次重复实验，测得“不知火”橘皮精油含量见表3，其中乐山“不知火”橘皮精油得率为3.50%，眉山“不知火”橘皮精油得率为2.00%，成都“不知火”橘皮精油得率为1.75%，平均橘皮精油得率为2.42%。
2.3 “不知火”柑橘皮中黄酮测定结果
根据测验方法进行3次重复行实验，测得“不知火”橘皮黄酮含量，其中乐山“不知火”橘皮黄酮含量为0.45 mg·g-1，眉山“不知火”橘皮黄酮含量为0.28 mg·g-1，成都“不知火”橘皮黄酮含量为0.24 mg·g-1，平均黄酮含量为0.32 mg·g-1。
3 小结与讨论
“不知火”柑橘因其奇特的果实外形，脆甜带点微酸的口感，个性化的外观和别具一格的风味成为其销售的亮点。又因其具有丰产性及与“椪柑”相当的耐寒性在四川省得到大面积种植[16-17]，大范围的种植需要加大对副产物柑橘皮渣的利用，目前对柑橘果皮的处理，主要有晒干入药和废弃，而并没有物尽其用。多个研究表明，果胶、精油、黄酮等化合物广泛存在于柑橘皮渣中且具有极大的开发利用价值[5]。果胶是一种植物多聚糖，是细胞壁的主要成分之一，作为天然的食品加入剂，它在食品、制药行业中扮演着不可替代的角色。此外，橘皮中所含的黄酮类化合物是许多中草药的有效成分，具有降低血糖血脂、抗氧化、调理肠道微生物和消化酶活性以此促进消化等多种生理功能，这些性质赋予它极高的食用和药用价值。为此，各国政府和医药、食品等行业都对它给予高度重视和热切关注。
本研究结果显示，乐山、眉山、成都3个地区的“不知火”柑橘皮中均含有丰富的果胶、精油和黄酮，但各有效成分含量因产地不同存在差异。在果胶得率方面，乐山和眉山果胶得率接近，成都的果胶得率最低，平均果胶得率为14.96%，造成差异的原因可能与气候、地势、土质及栽培方式不同有关，同时总体果胶得率较低[10]，可能因为“不知火”柑橘皮果胶提取工艺有待进一步优化。在精油提取方面，由于采取的是水蒸气蒸馏法而非压榨法，使得实验所得精油为透明澄清液体，还夹杂淡淡的橘皮清香，这表明通过蒸汽蒸馏提取的精油具有良好的外观、颜色和气味，且精油的产率也相对较高，一般柑橘皮精油出油率为1.2%～1.6%，而由“不知火”柑橘皮提取出的精油高达2.42%。本实验采取溶剂提取法提取柑橘皮总黄酮，与超声波辅助法、碱法提取等相比[18]，其方法简单，设备要求低，是目前常用的柑橘皮黄酮提取方法，本实验测得乐山“不知火”橘皮黄酮含量为0.45 mg·g-1，眉山“不知火”橘皮黄酮含量为0.28 mg·g-1，成都“不知火”橘皮黄酮含量为0.24 mg·g-1，平均黄酮含量为0.32 mg·g-1，存在一定的地区差异性。
全面利用柑橘各个部位，特别是原本作为废弃物的果皮渣，这不仅可以提高经济效益，还可以促进资源循环利用，为环境保护做了相应贡献，减少污染，因而具有良好的市场开发前景。本研究为综合开发和利用“不知火”柑橘皮的有效成分，获得更大的经济效益和社会效益提供了理论基础。
参考文献：
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[2] 马蓓蓓.柑橘皮中部分有效成分的提取及综合利用工艺的研究[D].武汉：华中师范大学，2001. [3] 何天富.柑橘学[M].北京：中國农业出版社，1999，154.
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（责任编辑：敬廷桃）