【摘 要】
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目的: 克隆羧肽酶Al(carboxypeptidase A1,CPA1)全酶及其活性中心基因,构建重组表达载体并分别对其进行诱导表达.分析表达产物的活性.
方法: 通过RT-PCR方法扩增出CPAl全
【机 构】
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第四军医大学西京医院检验科,西安710032
【出 处】
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中国生物化学与分子生物学会临床应用生物化学与分子生物学分会成立大会暨第一届临床应用生物化学与分子生物学学术大会
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目的: 克隆羧肽酶Al(carboxypeptidase A1,CPA1)全酶及其活性中心基因,构建重组表达载体并分别对其进行诱导表达.分析表达产物的活性.
方法: 通过RT-PCR方法扩增出CPAl全酶及活性中心基因,分别克隆入载体pGEM-Teasy,测序分析.将两段目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1,测序证实序列插入正确后转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白.表达产物经变性、复性、纯化后通过MTT试验和集落形成试验鉴定其活性.
结果: 获得了人CPA1全酶及活性中心基因,表达的全酶及活性中心蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约66000及46000处分别出现新生蛋白带.以包涵体形式存在的表达产物经变复性后体外细胞毒试验分析:CPA1具有较好的催化水解活性:CPA1 active center具有一定的活性,但对肿瘤细胞的杀伤效果较弱.
结论: 成功克隆人CPA1全酶及其活性中心基因并得到了原核表达产物,并对表达产物进行了活性分析.以此为契机进一步对其进行优化,将是对羧肽酶A1系统进行完善一个重大突破.
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