论文部分内容阅读
摘要 将一株高产酸植物乳杆菌，在含有马铃薯秧藤汁液的一组MRS液体培养基中连续转移接种培养，组内5个培养基中的秧藤汁液浓度呈阶梯性递增状态，对完成连续驯化培养后的菌种进行冷冻干燥保存。进一步将该驯化菌和未驯化菌进行同步解冻激活后，分别接入含有马铃薯秧藤固体颗粒的液体培养基中培养48 h，结束后分离出各自培养基中的马铃薯秧藤固体颗粒部分和液体部分，采用比色法分别测定固体和液体部分中糖苷生物碱的含量；分别测定液体部分的pH值和总细菌细胞数。结果表明：在驯化菌的培养体系中，总细菌细胞数含量显著高于对照组；pH值显著低于对照组；马铃薯秧藤固体颗粒中糖苷生物碱含量明显低于对照组；培养液中的糖苷生物碱显著高于对照组。
关键词 马铃薯秧藤；植物乳杆菌；糖苷生物碱；青贮饲料
中图分类号 S816.5 3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）14-0269-03
Study on the Cultivation of Lactobacillus of Adaptive Acclimation to the Juice of Potato Cane
ZHANG Xiong-jie 1 LU Peng-fei 2 CHEN Hao 3 LI Zhi-qiang 3 LIU Quan-guo 3
（1 Innner Mongolia Horizon Oasis Research Center of Characteristic Biologic Resource，Hohhot Innner Mongolia 010018；
2 Inner Mongolia Agriculture University； 3 Innner Mongolia Greed Seed industry of Potato Co.，Ltd）
Abstract In the experiment，the plant lactobacillus which have high acid production was transferred into a group of MRS liquid nutrient medium for the continuous transfer and cultivation，In this group of 5 liquid medium the juice of potato cane was the ladder of increasing state.Then，the freeze drying of the strains after continuous cultivation was carried out.Further，after thawing activation of the domesticated bacteria and not domesticated bacteria synchronously，They were inoculated to the liquid nutrient medium which included the juice of potato cane cultivate 48 h.After the training the potato cane solid particles and liquid parts in the medium was each separated.The contents of the Glycosides alkaloids in the solid and liquid parts were determined respectively by colorimetric method；pH values and total bacterial count were determined in the liquid parts.The results showed that in the cultivation system of the domesticated bacteria，the total bacterial cell number was significantly higher than that of the control group；pH value was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids content in the potato cane solid particles was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids in the liquid were significantly higher than those in the control group.
Key words potato cane；Lactobacillus plantarum；Glycosides alkaloids；silage
马铃薯秧藤是马铃薯植株的地上部分，是在收获块茎后剩余的副产品。在传统的马铃薯种植业中，秧藤一般作为废弃物被处理；在现代化的马铃薯种植业中，为促进块茎薯皮提早老化、便于机械收获土豆作业以及预防各类病原体传播，一般在土豆收获前几天至十几天，采用化学杀秧、机械打秧等方式，将秧藤打碎还田或清除出田地的田间管理措施，这使得马铃薯秧藤资源具有了容易收集、分布集中、数量庞大的可开发利用优势。研究表明，马铃薯秧藤不仅可以作为还田绿肥、青贮饲料[1-4]，而且马铃薯秧藤中含有的70余种生物活性物质[5-9]糖苷生物碱、茄尼醇、挥发油等均是具有开发价值的化工医药原料，具有很好的开发前景，但目前国内尚无成熟的综合开发利用技术。 鉴于秧藤生物碱在青贮压实操作中有一部分进入自由流动的汁液浸出，且生物碱能够溶于稀酸溶液的特点，在马铃薯秧藤综合开发利用中，一方面需要将秧藤青贮发酵产酸，使有害生物碱被乳酸溶解并随汁液脱出；另一方面要求溶出后进入汁液里的生物碱不被降解，能被进一步提取利用。选择高产酸性能的植物乳杆菌，更有利于促进这一过程。为此，需要对选定的高产酸性能的植物乳杆菌，在马铃薯秧藤汁液中进行适应性驯化培养。为此，开展了本研究工作，旨在为缓解马铃薯集中种植区（多为农牧交错地区）青贮饲料匮乏的问题，寻找一条具有高附加值的马铃薯秧藤生物活性物质提取加工路径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 马铃薯秧藤及汁液。鲜秧藤均采自内蒙古格瑞得马铃薯种业公司种植的种薯大田，品种为大西洋、费乌瑞它、克新1号、荷兰十五及布尔班克；汁液在使用前用压榨器取得；秧藤及汁液在加入培养基前预先灭菌处理。
1.1.2 仪器及试剂。试验在内蒙古农业大学生命科学院实验室进行。主要仪器：常规微生物实验仪器；主要试剂：四氢呋喃∶水∶乙腈∶乙酸（50∶30∶20∶1，V/V）混合提取液；0.03%（W/V）聚甲醛磷酸溶液；a-茄碱标准（krompotatosprouts），SIGMA，Chemistry Co U.S.A等。
1.1.3 供试菌种及准备。植物乳杆菌（Lactobacillus plantar-um），冻干安瓶原种ACCC11016购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。原种经过前期的培养研究，进一步从中驯化培育出一株高产酸菌，扩繁后再次冻干保存备用。用前再次活化：将冷冻干燥的菌种按无菌操作要求从安瓿管中取出，放入5 mL液体MRS培养基中，于28 ℃在培养箱中复苏48 h。取200 μL复苏后的菌种悬液涂布于MRS固体平板进行二次复苏，在培养箱中于28 ℃培养48 h后挑取单菌落进行划线培养。
1.1.4 培养基的配制。试验中使用的4种培养基分别为MRS液体培养基、MRS固体培养基、含马铃薯秧藤汁的液体培养基、含马铃薯秧藤颗粒的液体培养基。其中含马铃薯秧藤汁的液体培养基的配制：在MRS液体培养基的配方基础上，分别添加马铃薯秧藤汁20、40、80、160、320 mL后定容至1 000 mL，制成1、2、3、4、5号共5个浓度梯度的培养基；含马铃薯秧藤颗粒的液体培养基：在MRS液体培养基的配方基础上，添加马铃薯鲜秧藤切碎颗粒（2 mm≤？覫≤5 mm）100 g，后定容至1 000 mL。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌细胞计数法。培养液中的细菌数测定使用直接涂片计数法[10]。
1.2.2 糖苷生物碱含量测定方法。马铃薯鲜秧藤、秧藤汁液、发酵后秧藤碎颗粒、发酵后含秧藤汁培养基液中的生物碱（全称1，6-糖苷生物碱totalsglyeoalka-olids，下称TGA）含量的测定方法，采用周宝利[11]和霍权恭[12]的文献中使用的分光光度法，原理是TGA和聚甲醛磷酸可发生特定的呈色反应。①标样配制：吸取0.50 mL 0.8 g/L的a-茄碱标液于25 mL比色管中，准确加入4.00 mL聚甲醛磷酸显色剂，室温反应30 min，以试剂空白为参比，用1 cm比色皿，于620 nm波长处测定吸光度值。②试样前处理：称取马铃薯秧藤约50 g（或发酵后马铃薯秧藤碎颗粒约100 g、或发酵后含马铃薯藤汁培养液500 mL），加120 mL提取液，于高速组织捣碎机中捣碎10 imn并成浆状，快速滤纸过滤（其中发酵液样品需先作预想处理），滤液1 250 g离心5 min，准确量取上清液100 mL，加2 mL冰乙酸，超声波振荡5 min。氨水调节pH值至10.5，沸水浴浓缩至干，冷却后，用少量pH值10.5的氨水洗涤残留物2次，并以7 800倍重力离心，弃去清液。残留物水浴蒸干，用3.00 mL 7%磷酸溶解，7 800倍重力再离心5 min，清液供测定糖苷生物碱使用。
1.2.3 试验步骤。试验步骤分为四步，分别为乳酸菌适应性能的驯化培养→驯化培养效果检测试验→对秧藤脱毒能力测定→培养液中生物碱含量的测定，具体如表1所示。
（1）菌种适应性驯化培养。将激活的植物乳杆菌在MRS固体培养基划线培养，取菌落接种于1号“马铃薯秧藤汁液体培养基”中进行适应性驯化培养，48 h后转接入2号，以此方法依次接入3、4、5号。经过连续5个培养期的马铃薯秧藤汁液浓度递增的培养后，将所得菌种扩繁、冷冻干燥保存。
（2）驯化培养效果检测。以未驯化菌作为对照，将驯化菌接入含有秧藤颗粒的液体培养基中，分别培养24、48、72 h后，过滤去除秧藤颗粒，测试培养基液体部分中的pH值和细菌细胞数。
（3）秧藤脱毒能力测定。对上述（1）中冻干的驯化菌和未驯化前的冻干菌进行同步活化。将2种细菌分别接入“马铃薯秧藤颗粒液体培养基”中，培养48 h后，过滤培养液，挑拣选取马铃薯秧藤颗粒。将挑拣出的马铃薯秧藤颗粒称重，测试2种菌培养下马铃薯秧藤颗粒中糖苷生物碱的含量；同时测试未经过发酵的新鲜马铃薯秧藤颗粒作为共同的对照。
（4）浸出液中生物碱含量测定。对上述（1）中冻干的驯化菌和未驯化前的冻干菌进行同步活化。将2种细菌分别接入3组“马铃薯秧藤颗粒液体培养基”中，各自培养24、48、72 h后，终止培养，过滤培养液，去除薯秧藤颗粒，保留过滤的培养液。测试培养液中糖苷生物碱的含量。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的驯化培养结果
从表2可以看出，经过多代数驯化培养的乳酸菌，对含有秧藤汁培养基的适应性增强，繁殖数量多；而未经驯化的乳酸菌适应差，繁殖数量较少。该试验尚不能确定乳酸菌的遗传变异，但至少可以说明其对不同浓度秧藤汁有较强的适应性变化，应用在在马铃薯藤发酵生产实践中可以提高成活率，加快发酵速度。
关键词 马铃薯秧藤；植物乳杆菌；糖苷生物碱；青贮饲料
中图分类号 S816.5 3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）14-0269-03
Study on the Cultivation of Lactobacillus of Adaptive Acclimation to the Juice of Potato Cane
ZHANG Xiong-jie 1 LU Peng-fei 2 CHEN Hao 3 LI Zhi-qiang 3 LIU Quan-guo 3
（1 Innner Mongolia Horizon Oasis Research Center of Characteristic Biologic Resource，Hohhot Innner Mongolia 010018；
2 Inner Mongolia Agriculture University； 3 Innner Mongolia Greed Seed industry of Potato Co.，Ltd）
Abstract In the experiment，the plant lactobacillus which have high acid production was transferred into a group of MRS liquid nutrient medium for the continuous transfer and cultivation，In this group of 5 liquid medium the juice of potato cane was the ladder of increasing state.Then，the freeze drying of the strains after continuous cultivation was carried out.Further，after thawing activation of the domesticated bacteria and not domesticated bacteria synchronously，They were inoculated to the liquid nutrient medium which included the juice of potato cane cultivate 48 h.After the training the potato cane solid particles and liquid parts in the medium was each separated.The contents of the Glycosides alkaloids in the solid and liquid parts were determined respectively by colorimetric method；pH values and total bacterial count were determined in the liquid parts.The results showed that in the cultivation system of the domesticated bacteria，the total bacterial cell number was significantly higher than that of the control group；pH value was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids content in the potato cane solid particles was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids in the liquid were significantly higher than those in the control group.
Key words potato cane；Lactobacillus plantarum；Glycosides alkaloids；silage
马铃薯秧藤是马铃薯植株的地上部分，是在收获块茎后剩余的副产品。在传统的马铃薯种植业中，秧藤一般作为废弃物被处理；在现代化的马铃薯种植业中，为促进块茎薯皮提早老化、便于机械收获土豆作业以及预防各类病原体传播，一般在土豆收获前几天至十几天，采用化学杀秧、机械打秧等方式，将秧藤打碎还田或清除出田地的田间管理措施，这使得马铃薯秧藤资源具有了容易收集、分布集中、数量庞大的可开发利用优势。研究表明，马铃薯秧藤不仅可以作为还田绿肥、青贮饲料[1-4]，而且马铃薯秧藤中含有的70余种生物活性物质[5-9]糖苷生物碱、茄尼醇、挥发油等均是具有开发价值的化工医药原料，具有很好的开发前景，但目前国内尚无成熟的综合开发利用技术。 鉴于秧藤生物碱在青贮压实操作中有一部分进入自由流动的汁液浸出，且生物碱能够溶于稀酸溶液的特点，在马铃薯秧藤综合开发利用中，一方面需要将秧藤青贮发酵产酸，使有害生物碱被乳酸溶解并随汁液脱出；另一方面要求溶出后进入汁液里的生物碱不被降解，能被进一步提取利用。选择高产酸性能的植物乳杆菌，更有利于促进这一过程。为此，需要对选定的高产酸性能的植物乳杆菌，在马铃薯秧藤汁液中进行适应性驯化培养。为此，开展了本研究工作，旨在为缓解马铃薯集中种植区（多为农牧交错地区）青贮饲料匮乏的问题，寻找一条具有高附加值的马铃薯秧藤生物活性物质提取加工路径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 马铃薯秧藤及汁液。鲜秧藤均采自内蒙古格瑞得马铃薯种业公司种植的种薯大田，品种为大西洋、费乌瑞它、克新1号、荷兰十五及布尔班克；汁液在使用前用压榨器取得；秧藤及汁液在加入培养基前预先灭菌处理。
1.1.2 仪器及试剂。试验在内蒙古农业大学生命科学院实验室进行。主要仪器：常规微生物实验仪器；主要试剂：四氢呋喃∶水∶乙腈∶乙酸（50∶30∶20∶1，V/V）混合提取液；0.03%（W/V）聚甲醛磷酸溶液；a-茄碱标准（krompotatosprouts），SIGMA，Chemistry Co U.S.A等。
1.1.3 供试菌种及准备。植物乳杆菌（Lactobacillus plantar-um），冻干安瓶原种ACCC11016购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。原种经过前期的培养研究，进一步从中驯化培育出一株高产酸菌，扩繁后再次冻干保存备用。用前再次活化：将冷冻干燥的菌种按无菌操作要求从安瓿管中取出，放入5 mL液体MRS培养基中，于28 ℃在培养箱中复苏48 h。取200 μL复苏后的菌种悬液涂布于MRS固体平板进行二次复苏，在培养箱中于28 ℃培养48 h后挑取单菌落进行划线培养。
1.1.4 培养基的配制。试验中使用的4种培养基分别为MRS液体培养基、MRS固体培养基、含马铃薯秧藤汁的液体培养基、含马铃薯秧藤颗粒的液体培养基。其中含马铃薯秧藤汁的液体培养基的配制：在MRS液体培养基的配方基础上，分别添加马铃薯秧藤汁20、40、80、160、320 mL后定容至1 000 mL，制成1、2、3、4、5号共5个浓度梯度的培养基；含马铃薯秧藤颗粒的液体培养基：在MRS液体培养基的配方基础上，添加马铃薯鲜秧藤切碎颗粒（2 mm≤？覫≤5 mm）100 g，后定容至1 000 mL。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌细胞计数法。培养液中的细菌数测定使用直接涂片计数法[10]。
1.2.2 糖苷生物碱含量测定方法。马铃薯鲜秧藤、秧藤汁液、发酵后秧藤碎颗粒、发酵后含秧藤汁培养基液中的生物碱（全称1，6-糖苷生物碱totalsglyeoalka-olids，下称TGA）含量的测定方法，采用周宝利[11]和霍权恭[12]的文献中使用的分光光度法，原理是TGA和聚甲醛磷酸可发生特定的呈色反应。①标样配制：吸取0.50 mL 0.8 g/L的a-茄碱标液于25 mL比色管中，准确加入4.00 mL聚甲醛磷酸显色剂，室温反应30 min，以试剂空白为参比，用1 cm比色皿，于620 nm波长处测定吸光度值。②试样前处理：称取马铃薯秧藤约50 g（或发酵后马铃薯秧藤碎颗粒约100 g、或发酵后含马铃薯藤汁培养液500 mL），加120 mL提取液，于高速组织捣碎机中捣碎10 imn并成浆状，快速滤纸过滤（其中发酵液样品需先作预想处理），滤液1 250 g离心5 min，准确量取上清液100 mL，加2 mL冰乙酸，超声波振荡5 min。氨水调节pH值至10.5，沸水浴浓缩至干，冷却后，用少量pH值10.5的氨水洗涤残留物2次，并以7 800倍重力离心，弃去清液。残留物水浴蒸干，用3.00 mL 7%磷酸溶解，7 800倍重力再离心5 min，清液供测定糖苷生物碱使用。
1.2.3 试验步骤。试验步骤分为四步，分别为乳酸菌适应性能的驯化培养→驯化培养效果检测试验→对秧藤脱毒能力测定→培养液中生物碱含量的测定，具体如表1所示。
（1）菌种适应性驯化培养。将激活的植物乳杆菌在MRS固体培养基划线培养，取菌落接种于1号“马铃薯秧藤汁液体培养基”中进行适应性驯化培养，48 h后转接入2号，以此方法依次接入3、4、5号。经过连续5个培养期的马铃薯秧藤汁液浓度递增的培养后，将所得菌种扩繁、冷冻干燥保存。
（2）驯化培养效果检测。以未驯化菌作为对照，将驯化菌接入含有秧藤颗粒的液体培养基中，分别培养24、48、72 h后，过滤去除秧藤颗粒，测试培养基液体部分中的pH值和细菌细胞数。
（3）秧藤脱毒能力测定。对上述（1）中冻干的驯化菌和未驯化前的冻干菌进行同步活化。将2种细菌分别接入“马铃薯秧藤颗粒液体培养基”中，培养48 h后，过滤培养液，挑拣选取马铃薯秧藤颗粒。将挑拣出的马铃薯秧藤颗粒称重，测试2种菌培养下马铃薯秧藤颗粒中糖苷生物碱的含量；同时测试未经过发酵的新鲜马铃薯秧藤颗粒作为共同的对照。
（4）浸出液中生物碱含量测定。对上述（1）中冻干的驯化菌和未驯化前的冻干菌进行同步活化。将2种细菌分别接入3组“马铃薯秧藤颗粒液体培养基”中，各自培养24、48、72 h后，终止培养，过滤培养液，去除薯秧藤颗粒，保留过滤的培养液。测试培养液中糖苷生物碱的含量。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的驯化培养结果
从表2可以看出，经过多代数驯化培养的乳酸菌，对含有秧藤汁培养基的适应性增强，繁殖数量多；而未经驯化的乳酸菌适应差，繁殖数量较少。该试验尚不能确定乳酸菌的遗传变异，但至少可以说明其对不同浓度秧藤汁有较强的适应性变化，应用在在马铃薯藤发酵生产实践中可以提高成活率，加快发酵速度。