论文部分内容阅读
摘要[目的]了解病死黑斑原鮡表皮和肠道微生物群落的变化及其与黑斑原鮡死亡的关系。[方法]利用新一代高通量测序技术，研究病死黑斑原鮡表皮皮肤黏液和肠道内容物微生物群落的变化及其对黑斑原鮡死亡的影响。[结果]黑斑原鮡病变死亡后，肠道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6种优势微生物菌群减少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3种优势微生物菌群增加；黑斑原鮡病变死亡后其表皮皮肤黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8种优势微生物菌群减少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4种优势微生物菌群增加。[结论]细菌和真菌在黑斑原鮡表皮和腸道中菌群的变化，可能是导致黑斑原鮡病变死亡的主要原因之一。
关键词黑斑原鮡；表皮；肠道；微生物群落
中图分类号S917.1文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）08-0080-06
Study on the Microbial Community in the Epidermis and Intestinal Tract of Dead Glyptosternum maculatum
ZHOU Jianshe1， PAN Hu2， CHEN Meiqun1 et al （1.Institute of Fisheries Science， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032；2.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032）
Abstract[Objective] To investigate the changes of microbial community in the epidermis and intestinal tract of dead Glyptosternum maculatum and their relationship with the death of G. maculatum. [Method] The changes of microbial community in the epidermal mucus and intestinal contents of dead G. maculatum and their effects on the death of G. maculatum were studied by using new generation of high throughput sequencing technique. [Result] After G. maculatum died， six major microbial flora of Acinetobacter sp.，Flavobacterium sp.， Vagococcus sp.， Carnobacterium sp.， Bacillus sp. and Malassezia sp. in the intestinal tract of dead G. maculatum reduced， but three dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Tremellales and Agaricomycetes） increased. In the epidermal mucus of dead G. maculatum， 8 dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Vagococcus sp.， Providencia sp. ， Morganella sp.， Pleosporales， Mucorales， Tremellales， Agaricomycetes） decreased， but four dominant microbial flora （Acetobacter sp.， Proteus sp.， Carnobacterium sp. and Malassezia sp.） increased. [Conclusion] The microbial flora of bacteria and fungi in the epidermis and intestinal tract of G. maculatum might be one of main causes that led the lesions and death of G. maculatum.
Key wordsGlyptosternum maculatum；Epidermis；Intestinal tract；Microbial community
基金项目农业部公益性行业专项（201403012）；西藏自治区财政专项（藏财农指69号）。
作者简介周建设（1985—），男，甘肃会宁人，助理研究员，硕士，从事鱼类遗传育种与繁殖研究。*通讯作者，研究员，硕士，硕士生导师，从事农产品质量安全与检测技术、现代设施农业、水产养殖研究。 收稿日期2017-10-27；修回日期2018-01-02
黑斑原鮡（Glyptosternum maculatum），隶属鲇形目鮡科原鮡属，主要分布于我国西藏的雅鲁藏布江流域及印度的Indus River[1]。黑斑原鮡分布區水温常年低于15 ℃，水流较为湍急[1-2]，野性很强，人工驯化养殖困难，在人工驯养过程中往往因为皮肤溃烂等原因发生死亡。研究发现，鱼类肠道菌群的失衡可能引起多种疾病的产生，而一旦生病也会导致鱼类菌群结构发生变化[3-4]，溃疡病、烂鳍病等[5]皮肤疾病也能造成鱼类病变死亡。近年来，基于宏基因组的高通量测序技术的快速发展[6]，已被广泛应用于微生物群落组成多样性等研究领域。笔者采用Illumina高通量测序技术对黑斑原鮡健康个体和病变死亡个体的表皮皮肤黏液及肠道内容物的微生物多样性组成进行了分析，从宏基因组水平上探讨了黑斑原鮡病变死亡前后表皮和肠道微生物群落的变化。
1材料与方法
1.1试验材料
2015年4月在西藏自治区农牧科学院水产科学研究所养殖基地收集健康黑斑原鮡和病变死亡的黑斑原鮡各5条，体质量（161.7± 2.0）g，体长（26.0± 0.8）cm，在无菌条件下分别用50 mL灭菌离心管收集健康和病变死亡的黑斑原鮡的皮肤黏液及肠道内容物样品，分别编号为1号（病变死亡黑斑原鮡皮肤黏液样品）、2号（病变死亡黑斑原鮡肠道内容物样品）、3号（健康黑斑原鮡皮肤黏液样品）、4号（健康黑斑原鮡肠道内容物样品），所有样品于-20 ℃下保藏备用。
1.2试验方法
1.2.1基因组DNA的提取。
黑斑原鮡皮肤黏液和肠道内容物样品微生物总DNA使用TIANGEN公司土壤基因组DNA提取试剂盒（DP336）提取。所提取的DNA于-20 ℃下保存备用。
1.2.2细菌16S rDNA-V3区的PCR扩增及测序。
采用细菌V3区通用引物 338F/518R见表1。PCR扩增体系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，无菌水37.75 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京亿鸣复兴生物科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina Miseq。
1.2.3真菌18S rDNA部分片段的PCR扩增及测序。
采用巢式PCR扩增法扩增真菌18S rDNA区目的片段。巢式PCR第一轮扩增采用GeoA2/Geo11引物见表1，PCR扩增体系（50 μL）
如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，无菌水37.75 μL。巢式PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，扩增产物用 min Elute PCR Purefication Kit 纯化。巢式PCR第二轮扩增采用F-Primer/R-Primer引物见表1，PCR扩增体系（50 μL）为：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板38.75 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃30 s，72 ℃ 1 min，10个循环；94 ℃ 30 s，47 ℃30 s，72 ℃ 1 min，27个循环；72 ℃延伸10 min， 4 ℃下保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京亿鸣复兴生物科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina Miseq。
1.2.4生物信息学分析。
测序结果使用CASAVA 1.8.2 软件进行图像碱基识别，初步质量分析后得到测序数据（Pass Filter Data，PF data），应用软件Pandaseq（v2.7）和Trimmomatic（v0.33）软件进行数据优化分析，以获得高质量的序列数据。计算在 97% 的相似水平上每个样本的操作分类单元（OTU）的数量，并构建稀疏曲线[7]。利用Qiime 1.7 软件，并分别计算各样本α多样性指数和β多样性指数，分析方法为序列随即抽样的方法，用RDP classifier进行物种分类注释，以得到每个样本的群落组成。
2结果与分析
2.1不同样本微生物多样性分析
对黑斑原鮡病死表皮、病死肠道、健康表皮和健康肠道中高通量测序的数据进行统计（表2，表3），4个样本总共获得了115 185条合格的16S rDNA序列，有效序列的平均长度为189 bp，健康表皮和肠道的有效OUT数量明显少于病死表皮和肠道的OUT数量，表明病死表皮和肠道中的细菌多样性显著低于健康表皮和肠道中的细菌多样性。共获得567 663条合格的18S rDNA序列，有效序列平均长度为354 bp，和细菌的多样性统计不同，健康表皮的真菌多样性高于病死表皮，而健康肠道的真菌多样性低于病死表皮。基于Observed OTUs数，构建的稀释曲线（rarefaction curve）（图1）。从各样品的rarefaction曲线可以看出，各样品的曲线均趋向平坦，说明测序的数据量合理。
通过Chao指数、Shannon指数、Simpson指数和Good’s-coverage指数对样品的丰度及多样性进行比较分析（表4），Chao指数可反映各样本的菌群丰度，病死黑斑原鮡表皮和肠道中细菌丰度与健康表皮和肠道相比明显增加，分别增加了48.6%和44.6%；Shannon指数、Simpson指数和Good’s-coverage指数可反映出各样本的菌群多样性，病死黑斑原鮡表皮和肠道中细菌多样性与健康表皮和肠道相比有所减少，分别减少了15.4%和38.7%；病死黑斑原鮡表皮真菌多样性与健康表皮相比有所减少，而肠道中真菌的多样性有所增加。 2.2不同样本微生物丰度分析
为进一步明确病死与健康黑斑原鮡表皮和肠道中细菌与真菌的群落组成，使用RDP classifier对代表性序列进行物种分类注释。从图2可以看出，各样本16S rDNA在门水平下得到 41個细菌门，而18S rDNA 在门水平下只有4个真菌门。基于门水平下物种注释信息，选取丰度排名前20位的属，绘制物种丰度聚类图（图3）。从图3可以看出，细菌在属水平下明显被分为2类，真菌在属水平下分为5类。各样品中，Acinetobacter、Pseudomonas和Chryseobacterium在黑斑原鮡健康肠道中为优势种，其他菌属在各样品中丰度较低；真菌Malassezia 病死黑斑原鮡和健康黑斑原鮡皮肤与肠道中均有较高丰度， Tremellales 只在健康表皮中有较高丰度，Arachnida只在病死表皮中有较高丰度。
2.3不同样本微生物群落结构变化分析
对病死黑斑原鮡表皮和肠道微生物群落结构与健康黑斑原鮡表皮和肠道微生物群落结构进行对比分析（图4、图5），不动杆菌属（Acinetobacter）在健康表皮和健康肠道中为优势类群，占所有微生物相对比例为41.10%和43.86%；假单胞菌属细菌（Pseudomonas）在病死黑斑原鮡肠道中为优势类群，占所有微生物相对比例为26.44%；变形菌属（Dysgonomonas）在病死黑斑原鮡表皮中为优势类群，占所有微生物相对比例为43.34%。担子菌类真菌（Tremellales）在健康黑斑原鮡表皮中为优势类群，占所有微生物相对比例为52.9%；马拉色氏霉菌属（Malassezia）在病死黑斑原鮡表皮、肠道和健康黑斑原鮡肠道中为优势类群，占所有微生物相对比例分别为52.24%、94.22%和73.49%。
病死黑斑原鮡表皮和肠道中的微生物相比较健康黑斑原鮡表皮和肠道微生物发生明显改变（表5、表6），丰度排在
前20位的细菌属中14个属的丰度在病死黑斑原鮡表皮中有所增加，增加倍数最多的是变形菌属（Dysgonomonas），而厚壁菌门属（Rummeliibacillus）在病死黑斑原鮡表皮中未检测到； 17个属的丰度在病死黑斑原鮡肠道中有所增加，增加倍数最多的是毗邻单胞菌属（Plesiomonas），为270倍。丰度
3讨论与结论
3.1病死黑斑原鮡表皮微生物的变化
与其他动物不同，鱼类皮肤没有角质化，因此皮肤长期与水接触会导致鱼类的体表成为病原微生物最容易入侵的途径[8]。大量研究表明，鱼类表皮微生物是其重要的组成部分，表皮微生物可能直接影响到鱼类的正常生长发育、生理平衡等[9-10]。
该研究发现，黑斑原鮡因水霉菌病变死亡后其表皮皮肤及肠道细菌群落和真菌多样性的改变。张正等[11]研究了半滑舌鳎肠道微生物菌群结构变化，发现发生疾病后的鱼肠道细菌多样性较健康个体明显减少，与该研究结果相一致。黑斑原鮡病变死亡后其表皮皮肤黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8种优势微生物菌群在减少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4种优势微生物菌群在增加，其中Providencia sp.（19.41%）、Pleosporales（5.157%）、Mucorales（4.223%）菌群的减少和Proteus sp.（25.26%）、 Pseudomonas sp.（10.821%）菌群的增加尤为显著。
假单胞杆菌属细菌（Pseudomonas sp.）是低温腐败菌[12]。綦国红等[13]研究发现假单胞杆菌是一种导致鱼类等蛋白质含量丰富的食品腐败的重要腐败细菌，其通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子，以密度依赖的方式调控某些生理特性的表达，造成腐败。邹金虎[14]研究表明，假单胞杆菌能引起鱼类皮肤溃烂的细菌之一。漫游菌属是1989年Collin发现的新菌属[15]，模式种是河流漫游菌（Vagcoccus fluvialis），是从水或鲑鱼中分离到，而1990年、1999年、2000年报道了鲑漫游菌（Vagcoccus salmeninarum），Vagcoccus lutrae和Vagcoccus fessus，目前共有4个种，其中河流漫游菌有多种来源，包括人类临床标本（如血液、伤口等）和动物（如鸡、猪、牛等）中都可能存在该菌，鲑漫游菌是从死鱼中被发现的，lutra漫游菌是唯一来源于水獭的细菌，fessus漫游菌是从海豹和海豚中分离得到的，目前对漫游菌的致病性未知[16-19]。黄杆菌属（Flavobacterium）和肉杆菌属（Carnobacterium）是造成冷藏鱼类腐败变质的重要微生物类群[20]。马拉色霉菌属真菌（Malassezia sp.）[20]是一类嗜脂性条件致病菌，是造成动物多种皮肤疾病的常见菌群。因此，死亡的黑斑原鮡表皮的微生物群落中与腐败变质相关的微生物丰度增加。
3.2病死黑斑原鮡肠道微生物的变化
鱼的肠道内存在大量的微生物，与鱼类共存，在长期进化过程中与鱼类肠道形成了一个稳定的微生态系统，许多长期定居在鱼类肠道中微生物对鱼类具有营养、防御和免疫调节等生理功能，并且对其生长发育也具有重要作用[21]，鱼苗的肠道微生物群落在孵化后能够在数小时内完成定植，，定植菌可以调节消化道中的基因表达，创造出适宜的栖息环境，并防止其他细菌侵入[4]。
该研究发现，黑斑原鮡病变死亡后其肠道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6种优势微生物菌群减少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3种优势微生物菌群增加，其中Malassezia sp.（13.614%）菌群的减少和Pseudomonas sp.（39.06%）、Tremellales（8.748%）、Agaricomycetes（1.818%）菌群的增加较为明显。吴金凤等[22]研究发现肠道菌群对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）健康状态有指示作用，在发病对虾肠道中，Flavobacterium和Bacillus等有益菌的丰度显著降低，虾肠道细菌群落多样性显著低于健康对虾，而该研究中黑斑原鮡肠道中Flavobacterium和Bacillus丰度的高低，也可能作为其是否健康的标准。该研究还发现Pseudomonas sp. 的丰度与在肠道中的变化趋势与表皮中的趋势一致，Pseudomonas sp.是一种致病菌，可能引起感染疾病，引起死亡。这表明黑斑原鮡病变死亡是由细菌、真菌和病原动物共同作用的结果。 参考文献
[1]
刘鸿艳.黑斑原鮡同工酶的研究[D].武汉：华中农业大学，2006.
[2] 陈美群，李宝海，周建设，等.黑斑原鮡的生物学研究进展[J].安徽农業科学，2016，44（3）：59-61.
[3] WANG Y B，LI J R，LIN J D.Probiotics in aquaculture：Challenges and outlook[J].Aquaculture，2008，281（1/2/3/4）：1-4.
[4] BALCZAR J L，DE BLAS I，RUIZZARZUELA L，et al.The role of probiotics in aquaculture[J].Veterinary microbiology，2006，114（3/4）：173-186.
[5] 冯东岳.2009年我国大宗淡水养殖鱼病害调查及分析[J].水产学杂志，2010，23（4）：60-65.
[6] CAPORASO J G，KUCZYNSKI J，STOMBAUGH J，et al.QIIME allows analysis of highthroughput community sequencing data[J].Nature methods，2010，7（5）：335-336.
[7] HAMADY M，LOZUPONE C，KNIGHT R.Fast UniFrac：Facilitating highthroughput phylogenetic analyses of microbial co mmol/Lunities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data[J].ISME Journal，2010，4（1）：17-27.
[8] 陈超然.鱼类体表的防御反应[J].北京水产，2000（5）：12-13.
[9] KE X L，WANG J G，GU Z M，et al.Morphological and molecular phylogenetic analysis of two Saprolegnia sp. （Oomycetes） isolated from silver crucian carpand zebra fish[J].Mycological research，2009，113（5）：637-644.
[10] 黄光祥.养殖鱼肠道菌群分子生态的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
[11] 张正，廖梅杰，李彬，等.两种疾病发生对养殖半滑舌鳎肠道菌群结构的影响分析[J].水产学报，2014，38（9）：1565-1572.
[12] HOZBOR M C，SAIZ A I，YEANNES M I，et al.Microbiological changes and its correlation with quality indices during aerobic iced storage of sea salmon （Pseudopercis semifasciata）[J].LWTFood Science and Technology，2006，39（2）：99-104.
[13] 綦国红，董明盛，陈晓红，等.鱼源假单胞菌群体感应信号分子与腐败特性相关关系的研究[J].中国农业科学，2007，40（7）：1486-1491.
[14] 邹金虎.鱼类皮肤溃烂性疾病的探讨与防治[J].当代水产，2013（8）：77.
[15] 陈伟伟，陈拱立，洪锦春，等.首次分离一株漫游球菌[C]// 第九次全国环境微生物学术研讨会议论文集.杭州：中国微生物学会，浙江大学，2006.
[16] COLLINS M D，ASH C，FARROW J A，et al.16S ribosomal ribonucleic acid sequence analyses of lactococci and related taxa.Description of Vagococcus fluvialis gen.nov.sp.nov.[J].Journal of applied bacteriology，1989，67（4）：453-460.
[17] WALLBAKS S，MARTINEZMURCIA A J，FRYER J L，et al.16S rRNA sequence deter mination for members of the genus Carnobacterium and related lactic acid bacteria and description of Vagococcus salmoninarum sp.nov.[J].International journal of systematic bacteriology，1990，40（3）：224-230.
[18] LAWSON P A，FALSEN E，OHLEN M，et al.Vagococcus lutrae sp.nov，isolated from the commolon otter （Lutra lutra）[J].International journal of systematic bacteriology，1999，49（3）：1251-1254.
[19] HOYLES L，LAWSON P A，FOSTER G，et al.Vagococcus fessus sp.nov.，isolated from a seal and a harbour porpoise[J].International journal of systematic & evolutionary microbiology，2000，50（3）：1151-1154.
[20] 许振伟.冷藏鱼类腐败菌腐败能力分析[D].上海：上海海洋大学，2011.
[21] 高权新，吴天星，王进波.肠道微生物与寄主的共生关系研究进展[J].动物营养学报，2010，22（3）：519-526.
[22] 吴金凤，熊金波，王欣，等.肠道菌群对凡纳滨对虾健康的指示作用[J].应用生态学报，2016，27（2）：611-621.
关键词黑斑原鮡；表皮；肠道；微生物群落
中图分类号S917.1文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）08-0080-06
Study on the Microbial Community in the Epidermis and Intestinal Tract of Dead Glyptosternum maculatum
ZHOU Jianshe1， PAN Hu2， CHEN Meiqun1 et al （1.Institute of Fisheries Science， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032；2.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Lhasa，Tibet 850032）
Abstract[Objective] To investigate the changes of microbial community in the epidermis and intestinal tract of dead Glyptosternum maculatum and their relationship with the death of G. maculatum. [Method] The changes of microbial community in the epidermal mucus and intestinal contents of dead G. maculatum and their effects on the death of G. maculatum were studied by using new generation of high throughput sequencing technique. [Result] After G. maculatum died， six major microbial flora of Acinetobacter sp.，Flavobacterium sp.， Vagococcus sp.， Carnobacterium sp.， Bacillus sp. and Malassezia sp. in the intestinal tract of dead G. maculatum reduced， but three dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Tremellales and Agaricomycetes） increased. In the epidermal mucus of dead G. maculatum， 8 dominant microbial flora （Pseudomonas sp.， Vagococcus sp.， Providencia sp. ， Morganella sp.， Pleosporales， Mucorales， Tremellales， Agaricomycetes） decreased， but four dominant microbial flora （Acetobacter sp.， Proteus sp.， Carnobacterium sp. and Malassezia sp.） increased. [Conclusion] The microbial flora of bacteria and fungi in the epidermis and intestinal tract of G. maculatum might be one of main causes that led the lesions and death of G. maculatum.
Key wordsGlyptosternum maculatum；Epidermis；Intestinal tract；Microbial community
基金项目农业部公益性行业专项（201403012）；西藏自治区财政专项（藏财农指69号）。
作者简介周建设（1985—），男，甘肃会宁人，助理研究员，硕士，从事鱼类遗传育种与繁殖研究。*通讯作者，研究员，硕士，硕士生导师，从事农产品质量安全与检测技术、现代设施农业、水产养殖研究。 收稿日期2017-10-27；修回日期2018-01-02
黑斑原鮡（Glyptosternum maculatum），隶属鲇形目鮡科原鮡属，主要分布于我国西藏的雅鲁藏布江流域及印度的Indus River[1]。黑斑原鮡分布區水温常年低于15 ℃，水流较为湍急[1-2]，野性很强，人工驯化养殖困难，在人工驯养过程中往往因为皮肤溃烂等原因发生死亡。研究发现，鱼类肠道菌群的失衡可能引起多种疾病的产生，而一旦生病也会导致鱼类菌群结构发生变化[3-4]，溃疡病、烂鳍病等[5]皮肤疾病也能造成鱼类病变死亡。近年来，基于宏基因组的高通量测序技术的快速发展[6]，已被广泛应用于微生物群落组成多样性等研究领域。笔者采用Illumina高通量测序技术对黑斑原鮡健康个体和病变死亡个体的表皮皮肤黏液及肠道内容物的微生物多样性组成进行了分析，从宏基因组水平上探讨了黑斑原鮡病变死亡前后表皮和肠道微生物群落的变化。
1材料与方法
1.1试验材料
2015年4月在西藏自治区农牧科学院水产科学研究所养殖基地收集健康黑斑原鮡和病变死亡的黑斑原鮡各5条，体质量（161.7± 2.0）g，体长（26.0± 0.8）cm，在无菌条件下分别用50 mL灭菌离心管收集健康和病变死亡的黑斑原鮡的皮肤黏液及肠道内容物样品，分别编号为1号（病变死亡黑斑原鮡皮肤黏液样品）、2号（病变死亡黑斑原鮡肠道内容物样品）、3号（健康黑斑原鮡皮肤黏液样品）、4号（健康黑斑原鮡肠道内容物样品），所有样品于-20 ℃下保藏备用。
1.2试验方法
1.2.1基因组DNA的提取。
黑斑原鮡皮肤黏液和肠道内容物样品微生物总DNA使用TIANGEN公司土壤基因组DNA提取试剂盒（DP336）提取。所提取的DNA于-20 ℃下保存备用。
1.2.2细菌16S rDNA-V3区的PCR扩增及测序。
采用细菌V3区通用引物 338F/518R见表1。PCR扩增体系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq（5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，无菌水37.75 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京亿鸣复兴生物科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina Miseq。
1.2.3真菌18S rDNA部分片段的PCR扩增及测序。
采用巢式PCR扩增法扩增真菌18S rDNA区目的片段。巢式PCR第一轮扩增采用GeoA2/Geo11引物见表1，PCR扩增体系（50 μL）
如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板1 μL，无菌水37.75 μL。巢式PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，扩增产物用 min Elute PCR Purefication Kit 纯化。巢式PCR第二轮扩增采用F-Primer/R-Primer引物见表1，PCR扩增体系（50 μL）为：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，TakaRa Taq （5 U/μL） 0.25 μL，模板38.75 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃30 s，72 ℃ 1 min，10个循环；94 ℃ 30 s，47 ℃30 s，72 ℃ 1 min，27个循环；72 ℃延伸10 min， 4 ℃下保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后送交北京亿鸣复兴生物科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina Miseq。
1.2.4生物信息学分析。
测序结果使用CASAVA 1.8.2 软件进行图像碱基识别，初步质量分析后得到测序数据（Pass Filter Data，PF data），应用软件Pandaseq（v2.7）和Trimmomatic（v0.33）软件进行数据优化分析，以获得高质量的序列数据。计算在 97% 的相似水平上每个样本的操作分类单元（OTU）的数量，并构建稀疏曲线[7]。利用Qiime 1.7 软件，并分别计算各样本α多样性指数和β多样性指数，分析方法为序列随即抽样的方法，用RDP classifier进行物种分类注释，以得到每个样本的群落组成。
2结果与分析
2.1不同样本微生物多样性分析
对黑斑原鮡病死表皮、病死肠道、健康表皮和健康肠道中高通量测序的数据进行统计（表2，表3），4个样本总共获得了115 185条合格的16S rDNA序列，有效序列的平均长度为189 bp，健康表皮和肠道的有效OUT数量明显少于病死表皮和肠道的OUT数量，表明病死表皮和肠道中的细菌多样性显著低于健康表皮和肠道中的细菌多样性。共获得567 663条合格的18S rDNA序列，有效序列平均长度为354 bp，和细菌的多样性统计不同，健康表皮的真菌多样性高于病死表皮，而健康肠道的真菌多样性低于病死表皮。基于Observed OTUs数，构建的稀释曲线（rarefaction curve）（图1）。从各样品的rarefaction曲线可以看出，各样品的曲线均趋向平坦，说明测序的数据量合理。
通过Chao指数、Shannon指数、Simpson指数和Good’s-coverage指数对样品的丰度及多样性进行比较分析（表4），Chao指数可反映各样本的菌群丰度，病死黑斑原鮡表皮和肠道中细菌丰度与健康表皮和肠道相比明显增加，分别增加了48.6%和44.6%；Shannon指数、Simpson指数和Good’s-coverage指数可反映出各样本的菌群多样性，病死黑斑原鮡表皮和肠道中细菌多样性与健康表皮和肠道相比有所减少，分别减少了15.4%和38.7%；病死黑斑原鮡表皮真菌多样性与健康表皮相比有所减少，而肠道中真菌的多样性有所增加。 2.2不同样本微生物丰度分析
为进一步明确病死与健康黑斑原鮡表皮和肠道中细菌与真菌的群落组成，使用RDP classifier对代表性序列进行物种分类注释。从图2可以看出，各样本16S rDNA在门水平下得到 41個细菌门，而18S rDNA 在门水平下只有4个真菌门。基于门水平下物种注释信息，选取丰度排名前20位的属，绘制物种丰度聚类图（图3）。从图3可以看出，细菌在属水平下明显被分为2类，真菌在属水平下分为5类。各样品中，Acinetobacter、Pseudomonas和Chryseobacterium在黑斑原鮡健康肠道中为优势种，其他菌属在各样品中丰度较低；真菌Malassezia 病死黑斑原鮡和健康黑斑原鮡皮肤与肠道中均有较高丰度， Tremellales 只在健康表皮中有较高丰度，Arachnida只在病死表皮中有较高丰度。
2.3不同样本微生物群落结构变化分析
对病死黑斑原鮡表皮和肠道微生物群落结构与健康黑斑原鮡表皮和肠道微生物群落结构进行对比分析（图4、图5），不动杆菌属（Acinetobacter）在健康表皮和健康肠道中为优势类群，占所有微生物相对比例为41.10%和43.86%；假单胞菌属细菌（Pseudomonas）在病死黑斑原鮡肠道中为优势类群，占所有微生物相对比例为26.44%；变形菌属（Dysgonomonas）在病死黑斑原鮡表皮中为优势类群，占所有微生物相对比例为43.34%。担子菌类真菌（Tremellales）在健康黑斑原鮡表皮中为优势类群，占所有微生物相对比例为52.9%；马拉色氏霉菌属（Malassezia）在病死黑斑原鮡表皮、肠道和健康黑斑原鮡肠道中为优势类群，占所有微生物相对比例分别为52.24%、94.22%和73.49%。
病死黑斑原鮡表皮和肠道中的微生物相比较健康黑斑原鮡表皮和肠道微生物发生明显改变（表5、表6），丰度排在
前20位的细菌属中14个属的丰度在病死黑斑原鮡表皮中有所增加，增加倍数最多的是变形菌属（Dysgonomonas），而厚壁菌门属（Rummeliibacillus）在病死黑斑原鮡表皮中未检测到； 17个属的丰度在病死黑斑原鮡肠道中有所增加，增加倍数最多的是毗邻单胞菌属（Plesiomonas），为270倍。丰度
3讨论与结论
3.1病死黑斑原鮡表皮微生物的变化
与其他动物不同，鱼类皮肤没有角质化，因此皮肤长期与水接触会导致鱼类的体表成为病原微生物最容易入侵的途径[8]。大量研究表明，鱼类表皮微生物是其重要的组成部分，表皮微生物可能直接影响到鱼类的正常生长发育、生理平衡等[9-10]。
该研究发现，黑斑原鮡因水霉菌病变死亡后其表皮皮肤及肠道细菌群落和真菌多样性的改变。张正等[11]研究了半滑舌鳎肠道微生物菌群结构变化，发现发生疾病后的鱼肠道细菌多样性较健康个体明显减少，与该研究结果相一致。黑斑原鮡病变死亡后其表皮皮肤黏液中Pseudomonas sp.、Vagococcus sp.、Providencia sp.、Morganella sp.、Pleosporales、Mucorales、Tremellales和Agaricomycetes 8种优势微生物菌群在减少，而Acinetobacter sp.、Proteus sp.、Carnobacterium sp.和Malassezia sp.4种优势微生物菌群在增加，其中Providencia sp.（19.41%）、Pleosporales（5.157%）、Mucorales（4.223%）菌群的减少和Proteus sp.（25.26%）、 Pseudomonas sp.（10.821%）菌群的增加尤为显著。
假单胞杆菌属细菌（Pseudomonas sp.）是低温腐败菌[12]。綦国红等[13]研究发现假单胞杆菌是一种导致鱼类等蛋白质含量丰富的食品腐败的重要腐败细菌，其通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯（AHLs）类信号分子，以密度依赖的方式调控某些生理特性的表达，造成腐败。邹金虎[14]研究表明，假单胞杆菌能引起鱼类皮肤溃烂的细菌之一。漫游菌属是1989年Collin发现的新菌属[15]，模式种是河流漫游菌（Vagcoccus fluvialis），是从水或鲑鱼中分离到，而1990年、1999年、2000年报道了鲑漫游菌（Vagcoccus salmeninarum），Vagcoccus lutrae和Vagcoccus fessus，目前共有4个种，其中河流漫游菌有多种来源，包括人类临床标本（如血液、伤口等）和动物（如鸡、猪、牛等）中都可能存在该菌，鲑漫游菌是从死鱼中被发现的，lutra漫游菌是唯一来源于水獭的细菌，fessus漫游菌是从海豹和海豚中分离得到的，目前对漫游菌的致病性未知[16-19]。黄杆菌属（Flavobacterium）和肉杆菌属（Carnobacterium）是造成冷藏鱼类腐败变质的重要微生物类群[20]。马拉色霉菌属真菌（Malassezia sp.）[20]是一类嗜脂性条件致病菌，是造成动物多种皮肤疾病的常见菌群。因此，死亡的黑斑原鮡表皮的微生物群落中与腐败变质相关的微生物丰度增加。
3.2病死黑斑原鮡肠道微生物的变化
鱼的肠道内存在大量的微生物，与鱼类共存，在长期进化过程中与鱼类肠道形成了一个稳定的微生态系统，许多长期定居在鱼类肠道中微生物对鱼类具有营养、防御和免疫调节等生理功能，并且对其生长发育也具有重要作用[21]，鱼苗的肠道微生物群落在孵化后能够在数小时内完成定植，，定植菌可以调节消化道中的基因表达，创造出适宜的栖息环境，并防止其他细菌侵入[4]。
该研究发现，黑斑原鮡病变死亡后其肠道中Acinetobacter sp.、Flavobacterium sp.、Vagococcus sp.、Carnobacterium sp.、Bacillus sp.和Malassezia sp.6种优势微生物菌群减少，而Pseudomonas sp.、Tremellales和Agaricomycetes 3种优势微生物菌群增加，其中Malassezia sp.（13.614%）菌群的减少和Pseudomonas sp.（39.06%）、Tremellales（8.748%）、Agaricomycetes（1.818%）菌群的增加较为明显。吴金凤等[22]研究发现肠道菌群对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）健康状态有指示作用，在发病对虾肠道中，Flavobacterium和Bacillus等有益菌的丰度显著降低，虾肠道细菌群落多样性显著低于健康对虾，而该研究中黑斑原鮡肠道中Flavobacterium和Bacillus丰度的高低，也可能作为其是否健康的标准。该研究还发现Pseudomonas sp. 的丰度与在肠道中的变化趋势与表皮中的趋势一致，Pseudomonas sp.是一种致病菌，可能引起感染疾病，引起死亡。这表明黑斑原鮡病变死亡是由细菌、真菌和病原动物共同作用的结果。 参考文献
[1]
刘鸿艳.黑斑原鮡同工酶的研究[D].武汉：华中农业大学，2006.
[2] 陈美群，李宝海，周建设，等.黑斑原鮡的生物学研究进展[J].安徽农業科学，2016，44（3）：59-61.
[3] WANG Y B，LI J R，LIN J D.Probiotics in aquaculture：Challenges and outlook[J].Aquaculture，2008，281（1/2/3/4）：1-4.
[4] BALCZAR J L，DE BLAS I，RUIZZARZUELA L，et al.The role of probiotics in aquaculture[J].Veterinary microbiology，2006，114（3/4）：173-186.
[5] 冯东岳.2009年我国大宗淡水养殖鱼病害调查及分析[J].水产学杂志，2010，23（4）：60-65.
[6] CAPORASO J G，KUCZYNSKI J，STOMBAUGH J，et al.QIIME allows analysis of highthroughput community sequencing data[J].Nature methods，2010，7（5）：335-336.
[7] HAMADY M，LOZUPONE C，KNIGHT R.Fast UniFrac：Facilitating highthroughput phylogenetic analyses of microbial co mmol/Lunities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data[J].ISME Journal，2010，4（1）：17-27.
[8] 陈超然.鱼类体表的防御反应[J].北京水产，2000（5）：12-13.
[9] KE X L，WANG J G，GU Z M，et al.Morphological and molecular phylogenetic analysis of two Saprolegnia sp. （Oomycetes） isolated from silver crucian carpand zebra fish[J].Mycological research，2009，113（5）：637-644.
[10] 黄光祥.养殖鱼肠道菌群分子生态的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
[11] 张正，廖梅杰，李彬，等.两种疾病发生对养殖半滑舌鳎肠道菌群结构的影响分析[J].水产学报，2014，38（9）：1565-1572.
[12] HOZBOR M C，SAIZ A I，YEANNES M I，et al.Microbiological changes and its correlation with quality indices during aerobic iced storage of sea salmon （Pseudopercis semifasciata）[J].LWTFood Science and Technology，2006，39（2）：99-104.
[13] 綦国红，董明盛，陈晓红，等.鱼源假单胞菌群体感应信号分子与腐败特性相关关系的研究[J].中国农业科学，2007，40（7）：1486-1491.
[14] 邹金虎.鱼类皮肤溃烂性疾病的探讨与防治[J].当代水产，2013（8）：77.
[15] 陈伟伟，陈拱立，洪锦春，等.首次分离一株漫游球菌[C]// 第九次全国环境微生物学术研讨会议论文集.杭州：中国微生物学会，浙江大学，2006.
[16] COLLINS M D，ASH C，FARROW J A，et al.16S ribosomal ribonucleic acid sequence analyses of lactococci and related taxa.Description of Vagococcus fluvialis gen.nov.sp.nov.[J].Journal of applied bacteriology，1989，67（4）：453-460.
[17] WALLBAKS S，MARTINEZMURCIA A J，FRYER J L，et al.16S rRNA sequence deter mination for members of the genus Carnobacterium and related lactic acid bacteria and description of Vagococcus salmoninarum sp.nov.[J].International journal of systematic bacteriology，1990，40（3）：224-230.
[18] LAWSON P A，FALSEN E，OHLEN M，et al.Vagococcus lutrae sp.nov，isolated from the commolon otter （Lutra lutra）[J].International journal of systematic bacteriology，1999，49（3）：1251-1254.
[19] HOYLES L，LAWSON P A，FOSTER G，et al.Vagococcus fessus sp.nov.，isolated from a seal and a harbour porpoise[J].International journal of systematic & evolutionary microbiology，2000，50（3）：1151-1154.
[20] 许振伟.冷藏鱼类腐败菌腐败能力分析[D].上海：上海海洋大学，2011.
[21] 高权新，吴天星，王进波.肠道微生物与寄主的共生关系研究进展[J].动物营养学报，2010，22（3）：519-526.
[22] 吴金凤，熊金波，王欣，等.肠道菌群对凡纳滨对虾健康的指示作用[J].应用生态学报，2016，27（2）：611-621.