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【摘 要】 目的：建立诺氟沙星胶囊微生物限度检查方法。方法：采用平皿稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法。结果：采用平皿稀释法验证，白色念珠菌、黑曲霉回收率均能达到70%以上，联合采用离心沉淀法、薄膜过滤法验证大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率能达到70%以上，控制菌联合采用离心沉淀法、薄膜过滤法可检出大肠埃希菌。结论：诺氟沙星胶囊微生物限度检查，可联合采用离心沉淀法、薄膜过滤法检查细菌数、常规法检查霉菌和酵母菌总数；联合采用离心沉淀法、薄膜过滤法检查控制菌。
【关键词】 微生物限度检查法 离心沉淀法法 薄膜过滤法
【中图分类号】 R446.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）05-0322-01
诺氟沙星胶囊未曾有微生物限度检查方法学研究，故按中国药典2010年版二部操作方法对其进行微生物限度检查方法学的验证试验。该品种是喹诺酮类抗细菌药，沉淀较多，抑菌作用较强故联合采用离心沉淀法和薄膜过滤法进行细菌计数验证，采用平皿稀释法进行霉菌和酵母菌计数；控制菌验证中，联合采用离心沉淀法和薄膜过滤法对大肠埃希菌进行验证。
1 仪器、试药、供试品及菌种
1.1 仪器
CL—32L自动蒸汽灭菌器、SE2020电子天平（梅特勒—托利多常州衡器有限公司）、净化间、净化工作台。
1.2 培养基
营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖增菌液，改良马丁液体培养基、MUG培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[1]，以上培养基均来源于北京陆桥技术有限公司，培养基的制备按标示方法配置。
1.3 供试品
诺氟沙星胶囊。
1.4 菌种
大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003][1]菌种均来源于北京陆桥技术有限责任公司
2 方法与结果
2.1 菌液制备
按《中国药典》2010年版一部附录方法制备备用。
2.2 供试液制备按规定取本品10 g，加入 45°C 稀释剂至100ml振摇使其充分分散均匀，即为 1：10供试液；取 1：10供试液10ml，加入稀释剂至20ml，即为 1：20 供试液；取 1：10供试液10ml，加入稀释剂至40ml，即为 1：40供试液；取 1：10 供试液10ml，加入稀释剂至100ml，即为 1：100供试液。
2.3 细菌计数验证
2.3.1 试验组：取1：100供试液10ml 500r/min离心3分钟，底部沉淀约0.5ml，取全部上清约9.5ml至90ml稀释剂中，薄膜过滤法用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，最后一次冲洗液中加入50～100cfu试验菌，取膜贴于营养琼脂平皿上，平行测定两个膜；
2.3.2 菌液组：将与试验组同量的试验菌液加入冲洗液中，过滤，取膜贴于营养琼脂平皿上，平行测定两个膜；
2.3.3 稀释剂对照组：将与试验组同量的试验菌液加入10ml冲洗液中500r/min离心3分钟，取上层约9.5ml至滤筒中，薄膜过滤法冲洗5次100ml/次，平行测定两个膜，不加样与试验组同法操作；
2.3.4 阴性对照：取稀释剂过滤，取膜贴于营养琼脂平皿上。
结果见表1、2：
2.4 霉菌、酵母菌计数验证：取1：20供试液采用平皿稀释法1ml/皿，平行测定两个皿。结果见表3：
2.5 供试品对照组
2.5.1 细菌计数：取1：100供试液10ml 500r/min离心3分钟，底部沉淀约0.5ml，取全部上清约9.5ml至约90ml稀释液中，过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，取膜贴于营养琼脂平皿上，平行测定两个膜；记录见表4
2.5.2 霉菌酵母菌计数：取1：20供试液采用平皿稀释法1ml/皿，平行测定两个皿。结果见下表4
2.6 大肠埃希菌检查方法验证：
2.6.1 试验组：取1：40供试液40ml（10ml/支） 至离心管中500r/min离心3分钟，底部沉淀约1ml，取全部40ml溶液的上清液注入一个滤筒中，过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，最后一次冲洗液中加入50～100cfu的大肠埃希菌，取膜加入到400ml BL中。其他操作按中国药典2010版二部微生物限度检查法薄膜过滤法。
2.6.2 供试品组：1：40供试液取.40ml至4支离心管中 500r/min离心3分钟，底部沉淀约1ml，取全部40ml溶液的上清液注入一个滤筒中，方法按前述方法，薄膜过滤法用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，取膜加入到400ml BL中。
2.6.3 阴性对照：取10ml冲洗液加入至400BL中。记录及结果见表5
3 结论
经试验，诺氟沙星胶囊微生物限度方法：细菌计数方法为取1：100供试液10ml500r/min离心3分钟，底部沉淀约0.5ml，取全部上清液至90ml稀释剂中，薄膜过滤法过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100ml，平行测定两个膜按薄膜过滤法检查；霉菌酵母菌计数方法为1：20供试液1ml /皿，平行测定两个皿按平皿稀释法检查。控制菌方法：取1：40供试液40ml 500r/min离心3分钟，底部沉淀约1ml，全部40ml溶液的上清液注入约50ml稀释剂中，过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，取膜加入到400ml 胆盐乳糖增菌液中，操作按大肠埃希菌检查法检查。
4 讨论
本研究验证的目的是检验其方法的灵敏度、检出率（能否检出，方法可行性）。以确定检验方法的专属性，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查法。
本品为喹诺酮类抗菌药，对细菌有很强的抑菌作用，且沉淀较多，在试验时要考虑诸多因素对方法的影响，因此联合采用离心沉淀法和薄膜过滤法对其进行验证，生产企业在原、辅料、生产和检验等条件不变的情况下，可用上述方法进行检验。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].北京：化学工业出版社，2010：4
作者简介：马韵韵 女 汉 1982年 3月 学历：硕士 研究方向：微生物学 专业： 病原生物学 单位级别：省级事业单位 所在科室： 抗生素室
【关键词】 微生物限度检查法 离心沉淀法法 薄膜过滤法
【中图分类号】 R446.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-5160（2014）05-0322-01
诺氟沙星胶囊未曾有微生物限度检查方法学研究，故按中国药典2010年版二部操作方法对其进行微生物限度检查方法学的验证试验。该品种是喹诺酮类抗细菌药，沉淀较多，抑菌作用较强故联合采用离心沉淀法和薄膜过滤法进行细菌计数验证，采用平皿稀释法进行霉菌和酵母菌计数；控制菌验证中，联合采用离心沉淀法和薄膜过滤法对大肠埃希菌进行验证。
1 仪器、试药、供试品及菌种
1.1 仪器
CL—32L自动蒸汽灭菌器、SE2020电子天平（梅特勒—托利多常州衡器有限公司）、净化间、净化工作台。
1.2 培养基
营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖增菌液，改良马丁液体培养基、MUG培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[1]，以上培养基均来源于北京陆桥技术有限公司，培养基的制备按标示方法配置。
1.3 供试品
诺氟沙星胶囊。
1.4 菌种
大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003][1]菌种均来源于北京陆桥技术有限责任公司
2 方法与结果
2.1 菌液制备
按《中国药典》2010年版一部附录方法制备备用。
2.2 供试液制备按规定取本品10 g，加入 45°C 稀释剂至100ml振摇使其充分分散均匀，即为 1：10供试液；取 1：10供试液10ml，加入稀释剂至20ml，即为 1：20 供试液；取 1：10供试液10ml，加入稀释剂至40ml，即为 1：40供试液；取 1：10 供试液10ml，加入稀释剂至100ml，即为 1：100供试液。
2.3 细菌计数验证
2.3.1 试验组：取1：100供试液10ml 500r/min离心3分钟，底部沉淀约0.5ml，取全部上清约9.5ml至90ml稀释剂中，薄膜过滤法用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，最后一次冲洗液中加入50～100cfu试验菌，取膜贴于营养琼脂平皿上，平行测定两个膜；
2.3.2 菌液组：将与试验组同量的试验菌液加入冲洗液中，过滤，取膜贴于营养琼脂平皿上，平行测定两个膜；
2.3.3 稀释剂对照组：将与试验组同量的试验菌液加入10ml冲洗液中500r/min离心3分钟，取上层约9.5ml至滤筒中，薄膜过滤法冲洗5次100ml/次，平行测定两个膜，不加样与试验组同法操作；
2.3.4 阴性对照：取稀释剂过滤，取膜贴于营养琼脂平皿上。
结果见表1、2：
2.4 霉菌、酵母菌计数验证：取1：20供试液采用平皿稀释法1ml/皿，平行测定两个皿。结果见表3：
2.5 供试品对照组
2.5.1 细菌计数：取1：100供试液10ml 500r/min离心3分钟，底部沉淀约0.5ml，取全部上清约9.5ml至约90ml稀释液中，过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，取膜贴于营养琼脂平皿上，平行测定两个膜；记录见表4
2.5.2 霉菌酵母菌计数：取1：20供试液采用平皿稀释法1ml/皿，平行测定两个皿。结果见下表4
2.6 大肠埃希菌检查方法验证：
2.6.1 试验组：取1：40供试液40ml（10ml/支） 至离心管中500r/min离心3分钟，底部沉淀约1ml，取全部40ml溶液的上清液注入一个滤筒中，过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，最后一次冲洗液中加入50～100cfu的大肠埃希菌，取膜加入到400ml BL中。其他操作按中国药典2010版二部微生物限度检查法薄膜过滤法。
2.6.2 供试品组：1：40供试液取.40ml至4支离心管中 500r/min离心3分钟，底部沉淀约1ml，取全部40ml溶液的上清液注入一个滤筒中，方法按前述方法，薄膜过滤法用 45°C pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，取膜加入到400ml BL中。
2.6.3 阴性对照：取10ml冲洗液加入至400BL中。记录及结果见表5
3 结论
经试验，诺氟沙星胶囊微生物限度方法：细菌计数方法为取1：100供试液10ml500r/min离心3分钟，底部沉淀约0.5ml，取全部上清液至90ml稀释剂中，薄膜过滤法过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液冲洗5次，每次100ml，平行测定两个膜按薄膜过滤法检查；霉菌酵母菌计数方法为1：20供试液1ml /皿，平行测定两个皿按平皿稀释法检查。控制菌方法：取1：40供试液40ml 500r/min离心3分钟，底部沉淀约1ml，全部40ml溶液的上清液注入约50ml稀释剂中，过滤用 45°C pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液冲洗5次，100ml/次，取膜加入到400ml 胆盐乳糖增菌液中，操作按大肠埃希菌检查法检查。
4 讨论
本研究验证的目的是检验其方法的灵敏度、检出率（能否检出，方法可行性）。以确定检验方法的专属性，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查法。
本品为喹诺酮类抗菌药，对细菌有很强的抑菌作用，且沉淀较多，在试验时要考虑诸多因素对方法的影响，因此联合采用离心沉淀法和薄膜过滤法对其进行验证，生产企业在原、辅料、生产和检验等条件不变的情况下，可用上述方法进行检验。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].北京：化学工业出版社，2010：4
作者简介：马韵韵 女 汉 1982年 3月 学历：硕士 研究方向：微生物学 专业： 病原生物学 单位级别：省级事业单位 所在科室： 抗生素室