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【摘 要】近年来，肠道病毒71引发的手足口病发病率在我国呈上升趋势，严重危害儿童健康。本研究利用已有的重组原核表达载体pET32a-VP1，在大肠杆菌BL21内诱导其表达VP1融合蛋白，使用镍柱亲和层析纯化重组蛋白，SDS-PAGE结果表明重组蛋白表达且纯化浓度较高，可用于今后的EV71抗原表位筛选与抗EV71病毒疫苗开发研究。
【关键词】肠道病毒71；VP1；重组蛋白；纯化
[Abstract] Recently， Hand-foot-mouth disease （HFMD） caused by Enterovirus 71 （EV 71） outbreak widely in China， which endanger children’s health. In this study， pET32a-VP1 was expressed in E.coli BL21 with the inducement of IPTG. The recombination protein was purified by Ni2 -NTA and indentified by SDS-PAGE， the result of which showed high purity of the recombination protein of VP1.It could provide the bases for research of EV71 epitope screening and new anti-EV71 vaccines.
[Key words] EV71； VP1； Recombination protein； Purification
柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）等肠道病毒是引起手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD）的主要病原体[1]，在我国，尤其以柯萨奇病毒A组16型（COX A16）与EV71最为常见。但感染除了引起HFMD外，EV71还能够引起脊髓灰质炎样麻痹、无菌性脑膜炎、脑干脑炎和等多种与神经系统相关的症状[2]。自1969年首次被分离以来，EV71病毒已在美国、澳大利亚、欧洲和东南亚等地内引起十多次暴发与流行[3-6]。我国自2008年3月以来，已在多个省份出现了HFMD的流行[7]，而且由于HFMD潜伏期长，症状不明显，治疗极易延误，因此，开发相应疫苗类与快速诊断试剂是防控HFMD的主要方法。EV71病毒颗粒由二十面体的球形蛋白外壳和其中包裹的单链正义RNA组成，其中外壳蛋白由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成[8]。研究表明，VP1、VP2、VP3上含有EV71的主要抗原决定簇[9]。本研究利用已构建完成的pET32a-VP1原核表达载体，进行了诱导表达，蛋白质纯化与鉴定，以期为今后肠道病毒EV71疫苗的开发提供技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
重组质粒pET32a-VP1与大肠杆菌BL21为本实验室保藏，质粒提取试剂盒与Ni2 -NTA柱料购自天根生化科技（北京）有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
VP1蛋白诱导表达将pET32a-VP1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有卡那霉素（50mg/mL）的LB平板过夜培养，次日挑取阳性菌落并接种于 100 mL 含有卡那霉素（50mg/mL）LB 液体培养基中，37℃，180 r/min过夜培养。以1%的接种量接种到1 L含有卡那霉素（50mg/mL）LB液体培养基中，37℃，180 r/min 培养。以比浊法检测600nm下OD值，当 OD值为0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（0.2 mmol/L）进行诱导，16℃，180 r/min培养过夜。次日4℃，5000 r/min下离心收集菌体细胞沉淀。使用20 mL结合缓冲液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25 mmol/L，咪唑pH7.4）重悬菌体细胞，并加入抑肽酶（100 mg/L）与亮抑酶肽（100 mg/L），抑制蛋白酶活性。
镍柱亲和层析在1200 bar压力下超声波破碎细胞，4℃，12000 r/min离心，取上清液过镍柱两次。用1mL结合缓冲液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25mmol/L 咪唑，pH7.4）洗涤柱子，重复两次。用1mL洗脱缓冲液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH7.4）洗脱目的蛋白，重复3次，收集洗脱液，进行SDS-PAGE 分析。
2 结果与分析
pET32a-VP1转化后的大肠杆菌BL21经过诱导表达，细胞破碎，离镍柱亲和层析纯化与SDS-PAGE检测，电泳结果表明在接近40kDMarker处有目的蛋白条带（图1），与预期产物大小（42kD）一致，表明本重组蛋白表达量较高、杂蛋白含量少。
本研究在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达重组pET32a-VP1蛋白，产物经过细胞破碎，镍柱亲和层析纯化与SDS-PAGE鉴定，表明本重组蛋白表达量较高，杂质少，溶解性高。在本研究的基础上，可以进一步进行肠道病毒EV71抗血清制备及其免疫原性分析等研究，从而为HFMD新型疫苗的开发提供前期基础。
参考文献：
[1] 金奇.医学分子病毒学[M].北京：科学出版社，2000：606-613.
[2] Chumakov M， Voroshilova M， Shindarov L， et al. Enterovirus 71 isolated from cases of epidemic poliomyelitis-like disease in bulgaria[J]. Arch Virol， 1979， 60（3/4）： 329-340.
【关键词】肠道病毒71；VP1；重组蛋白；纯化
[Abstract] Recently， Hand-foot-mouth disease （HFMD） caused by Enterovirus 71 （EV 71） outbreak widely in China， which endanger children’s health. In this study， pET32a-VP1 was expressed in E.coli BL21 with the inducement of IPTG. The recombination protein was purified by Ni2 -NTA and indentified by SDS-PAGE， the result of which showed high purity of the recombination protein of VP1.It could provide the bases for research of EV71 epitope screening and new anti-EV71 vaccines.
[Key words] EV71； VP1； Recombination protein； Purification
柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）等肠道病毒是引起手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD）的主要病原体[1]，在我国，尤其以柯萨奇病毒A组16型（COX A16）与EV71最为常见。但感染除了引起HFMD外，EV71还能够引起脊髓灰质炎样麻痹、无菌性脑膜炎、脑干脑炎和等多种与神经系统相关的症状[2]。自1969年首次被分离以来，EV71病毒已在美国、澳大利亚、欧洲和东南亚等地内引起十多次暴发与流行[3-6]。我国自2008年3月以来，已在多个省份出现了HFMD的流行[7]，而且由于HFMD潜伏期长，症状不明显，治疗极易延误，因此，开发相应疫苗类与快速诊断试剂是防控HFMD的主要方法。EV71病毒颗粒由二十面体的球形蛋白外壳和其中包裹的单链正义RNA组成，其中外壳蛋白由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成[8]。研究表明，VP1、VP2、VP3上含有EV71的主要抗原决定簇[9]。本研究利用已构建完成的pET32a-VP1原核表达载体，进行了诱导表达，蛋白质纯化与鉴定，以期为今后肠道病毒EV71疫苗的开发提供技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
重组质粒pET32a-VP1与大肠杆菌BL21为本实验室保藏，质粒提取试剂盒与Ni2 -NTA柱料购自天根生化科技（北京）有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
VP1蛋白诱导表达将pET32a-VP1转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有卡那霉素（50mg/mL）的LB平板过夜培养，次日挑取阳性菌落并接种于 100 mL 含有卡那霉素（50mg/mL）LB 液体培养基中，37℃，180 r/min过夜培养。以1%的接种量接种到1 L含有卡那霉素（50mg/mL）LB液体培养基中，37℃，180 r/min 培养。以比浊法检测600nm下OD值，当 OD值为0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（0.2 mmol/L）进行诱导，16℃，180 r/min培养过夜。次日4℃，5000 r/min下离心收集菌体细胞沉淀。使用20 mL结合缓冲液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25 mmol/L，咪唑pH7.4）重悬菌体细胞，并加入抑肽酶（100 mg/L）与亮抑酶肽（100 mg/L），抑制蛋白酶活性。
镍柱亲和层析在1200 bar压力下超声波破碎细胞，4℃，12000 r/min离心，取上清液过镍柱两次。用1mL结合缓冲液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25mmol/L 咪唑，pH7.4）洗涤柱子，重复两次。用1mL洗脱缓冲液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH7.4）洗脱目的蛋白，重复3次，收集洗脱液，进行SDS-PAGE 分析。
2 结果与分析
pET32a-VP1转化后的大肠杆菌BL21经过诱导表达，细胞破碎，离镍柱亲和层析纯化与SDS-PAGE检测，电泳结果表明在接近40kDMarker处有目的蛋白条带（图1），与预期产物大小（42kD）一致，表明本重组蛋白表达量较高、杂蛋白含量少。
本研究在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达重组pET32a-VP1蛋白，产物经过细胞破碎，镍柱亲和层析纯化与SDS-PAGE鉴定，表明本重组蛋白表达量较高，杂质少，溶解性高。在本研究的基础上，可以进一步进行肠道病毒EV71抗血清制备及其免疫原性分析等研究，从而为HFMD新型疫苗的开发提供前期基础。
参考文献：
[1] 金奇.医学分子病毒学[M].北京：科学出版社，2000：606-613.
[2] Chumakov M， Voroshilova M， Shindarov L， et al. Enterovirus 71 isolated from cases of epidemic poliomyelitis-like disease in bulgaria[J]. Arch Virol， 1979， 60（3/4）： 329-340.