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摘要：目的 通过山豆根水煎液对小鼠灌胃，观测其毒性反应，对其临床疗效和安全性进行评估，为临床用药提供参考。方法 连续14d给小鼠灌胃山豆根水煎液，观察小鼠状况，计算其半数致死量（LD50），另取小鼠按不同时间点分组，测量体重变化，测定血液生化指标，分别计算肝脏指数。结果 山豆根水煎液灌胃给药的LD50为16.4686g/kg，LD50的95%可信限为14.7501～17.6027g/kg，给药后第l天山豆根水煎液未对小鼠肝脏造成明显损伤，连续给药14天后小鼠出现体重增长缓慢，血清中ALT、AST活性升高，TBil含量升高，ALB含量下降，肝脏指数增大，上述变化随给药时间的延长而加重。结论 长期给小鼠灌胃山豆根水煎液可造成明显的肝损伤。
关键词：山豆根；抗肿瘤；毒性实验
中图分类号：R99 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）5-027-02
山豆根（Radix et Rhizoma Sophorae Tonkinensise）为豆科槐属植物越南槐的干燥根茎，主产于广西、贵州，又名广豆根、苦豆根、柔枝槐、山大豆根等。其主要成分为生物碱、黄酮、皂苷、多糖等，山豆根提取物对体肿瘤细胞的生长有较好的抑制作用，其水体物和醇提物均能抑制多种肿瘤细胞生长。被认为对肿瘤有特殊的治疗价值。另外，山豆根具有抗肝炎、抗肝损伤、抗病毒活性等作用。随着山豆根的广泛使用，其临床不良反应报道亦日益增多，尤其是发现肝、肾毒性的报道日渐增多，本实验旨在对该药的毒性作用进行较为系统的研究，为抗肿瘤药的合理应用和安全性奠定文献基础并提供新的评价依据。
1 仪器与材料
1.1药材及制备
1.1.1山豆根水煎液的制备：
取山豆根药材1kg，加10倍量的水浸泡0.5h，武火煎煮，水沸腾后改为文火煎煮30min，过滤药液，药渣再加3倍量的水，按上述煎法，煎煮完毕过滤药液，合并两次滤液，浓缩至2.5g/ml，置于冰箱冷藏室中，备用。
用时按照需要剂量折算后，按等体积不同浓度原则配置。
1.2实验动物
健康成年小鼠，SPF级，雌雄各半，体量18～22g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2005-0001。
饲养条件：室温24±2℃，相对湿度40～70%，动物饲以全价营养颗粒饲料，饮用水为无菌水，自由饮食及饮水。实验前先喂养7天，为适应期。
1.3实验主要仪器
金诺JF1204电子天平：深圳华恒仪器有限公司产品
BM830全自动血细胞分析仪：泰安市泰诺科贸有限公司产品
UV754紫外可见分光光度计：日本岛津公司产品
L320生物显微镜：深圳西派克光学仪器有限公司生产产品
单道可调式移液器：广州雷得生物技术有限公司产品
GL—20B高速冷冻离心机：上海安亭仪器设备有限公司
1.4实验试剂
白蛋白（ALB）试剂盒（批号：20101027）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号：20100922）；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号：20101027）；总胆红素（TBil）试剂盒（批号：20090614），均购自上海锐谷生物科技有限公司。
2 实验方法
2.1半数致死量（LD50）的测定
2.1.1山豆根组小鼠灌胃给药半数致死量（LD50）的测定：
首次预实验：取15只小鼠，雌雄各半，按体质量、性别分层随机法分为3组，每组5只。以20.54g·kg-1为预试1组剂量，按剂量等比级数1∶0.5计算，得到预试2组剂量为10.27g·kg-1、预试3组剂量为5.14g·kg-1。禁食（不禁水）12h后，各组均按25ml/kg灌胃，给药后记录动物的即时反应并连续观察2d，结果不能确定小鼠死亡率（P）为0%的剂量（Dn），因此须进一步确定小鼠死亡率（P）为0%的剂量（Dn）。
二次预实验：取15只小鼠，雌雄各半，按体质量、性别分层随机法分为3组，每组5只，以5.14g·kg-1为最高灌胃剂量，剂量等比级数为1∶0.5，依次取3个浓度给3组小鼠，分别为5.14，2.57，1.29g·kg-1，各组灌胃1次后观察2d。综合2次预试结果，以5.14g·kg-1的剂量灌胃后，P=1；以1.29g·kg-1的剂量灌胃后，P=0。由此，山豆根水煎液Dm约为5.14g·kg-1，Dn约为1.29g·kg-1。见下表。
综合两次预试结果，推测小鼠灌胃山豆根水煎液的死亡率（P）为0%的剂量（Dn）为1.29g·kg-1，小鼠P为100%的剂量（Dm）为5.14g·kg-1。
正式实验：取60只健康小鼠，随机分为6组，其中5组为给药组，1组为对照组，雌雄各半，实验前禁食12h，正常饮水，根据预试验结果中LD0和LD100剂数量，测定组间剂量比值为1：0.76。取配成一定浓度的山豆根水煎液，并设置溶剂对照组，给药组按25ml/kg的给药体积对小鼠进行灌胃，对照组同时灌胃等体积蒸馏水，给药后观察2d；观察并记录动物给药后一般状况和死亡情况，计算LD50及LD50的95%水平的置信区间。
山豆根组小鼠灌胃给药半数致死量（LD50）的结果，见下表。
用Bliss法程序计算得山豆根组小鼠灌胃给药半数致死量LD50为16.4686g/kg，LD50的95%可信限为14.7501～17.6027g/kg。
2.2药物毒性的对照
2.2.1实验动物分组及给药：
健康小鼠30只，雌雄各半，随机分为2组，分别为空白组、山豆根水煎液组，每组15只，各组动物按25ml/kg每日灌胃一次，空白组给以等量的蒸馏水，连续给药14天，给药期间动物自由摄食饮水。未次给药后一定时间，动物禁食不禁水12小时，每组随机抽取小鼠8只，取血进行血生化检测，取血后小鼠处死作系统尸检和病理组织学检查。 2.2.2小鼠给药后一般情况观察：
给药期间每日观察记录小鼠毛色、活动、精神状态、进食饮水、大小便等一般情况及出现的毒性症状、体征；小鼠定时称重，记录给药期体重变化。称重间隔根据各组分给药时间确定，定时检测小鼠日食量、水量变化，检测时间间隔根据各组分给药时间确定。
2.2.3小鼠给药后血液生化学检查：
眼眶静脉丛取血，3000r·min-1，4℃离心10min，用移液器取上层血清，以全自动生化分析仪测定血清中ALB、ALT、AST和TBil。
2.2.4计算肝脏指数并观察小鼠重要组织病理学变化：
摘肝脏并称重量，计算肝脏指数。
3 实验结果
3.1半数致死量（LD50）的计算
实验结束后，将所得数据用Bliss法程序计算得山豆根水煎液组小鼠灌胃给药半数致死量LD50为16.4686g/kg，LD50的95%可信限为14.7501～17.6027g/kg。
3.2给药后小鼠一般状况观察结果
通过观察，实验期间空白对照组的小鼠活动、毛色、精神状况、进食饮水、大小便等一般情况均正常。山豆根组小鼠在给药期间体重增长缓慢，给药后第8天观察，山豆根组小鼠部分出现狂躁、多动、精神不佳、毛色较差、体重增长缓慢等特点，给药后14天山豆根组小鼠体重与空白对照组比较呈显著性差异，随给药时间的延长体重差异增大；山豆根组小鼠在给药期间日摄食量逐渐减少；山豆根组小鼠在给药期间日水量增加缓慢。给药期间体重测定见下表。
3.3给药后小鼠血清生化学检测结果
提取各组小鼠眼眶静脉血清，进行血液生化学检查，结果进行组间t检验，见表6。
结果表示，药后14天，空白对照组的小鼠血清中白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）活力均在正常范围内；小鼠灌胃山豆根水煎液14天，可使小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）活性均明显升高，白蛋白（ALB）含量稍有降低。
4 讨论
半数致死量（LD50）是对药物毒性大小的粗略估计，是评价药物优劣的重要参数。LD50与药物毒性成反比，即致死量越小，毒性越大；致死量越大，毒性越小。本次实验测得的数据说明，作为抗肿瘤用药，山豆根的药物毒性较大，且毒性损伤集中在肝脏。
小鼠血清中ALT、AST、TBil等指标与肝毒性损伤具有很强的相关性，可作为评价中药致肝毒性损伤的一级筛选指标，此次实验结果中可看出，山豆根给药组小鼠的ALT、AST、TBil含量升高，说明山豆根可引起肝毒性损伤。
本实验对抗肿瘤药物山豆根的药物毒性进行了探讨，通过药物毒性评价，为药物的合理应用和进一步研究提供了必要的参考。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010版一部.北京：中国医药科技出版社，2010：25.
[2] 姚光弼.肝脏损伤的机制[J].中华消化杂志，1998.18（4）：235-238.
[3]公素琴，朱盂国.山豆根毒副反应综述[J].云南中医中药杂志，2004，25：48—49.
关键词：山豆根；抗肿瘤；毒性实验
中图分类号：R99 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）5-027-02
山豆根（Radix et Rhizoma Sophorae Tonkinensise）为豆科槐属植物越南槐的干燥根茎，主产于广西、贵州，又名广豆根、苦豆根、柔枝槐、山大豆根等。其主要成分为生物碱、黄酮、皂苷、多糖等，山豆根提取物对体肿瘤细胞的生长有较好的抑制作用，其水体物和醇提物均能抑制多种肿瘤细胞生长。被认为对肿瘤有特殊的治疗价值。另外，山豆根具有抗肝炎、抗肝损伤、抗病毒活性等作用。随着山豆根的广泛使用，其临床不良反应报道亦日益增多，尤其是发现肝、肾毒性的报道日渐增多，本实验旨在对该药的毒性作用进行较为系统的研究，为抗肿瘤药的合理应用和安全性奠定文献基础并提供新的评价依据。
1 仪器与材料
1.1药材及制备
1.1.1山豆根水煎液的制备：
取山豆根药材1kg，加10倍量的水浸泡0.5h，武火煎煮，水沸腾后改为文火煎煮30min，过滤药液，药渣再加3倍量的水，按上述煎法，煎煮完毕过滤药液，合并两次滤液，浓缩至2.5g/ml，置于冰箱冷藏室中，备用。
用时按照需要剂量折算后，按等体积不同浓度原则配置。
1.2实验动物
健康成年小鼠，SPF级，雌雄各半，体量18～22g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2005-0001。
饲养条件：室温24±2℃，相对湿度40～70%，动物饲以全价营养颗粒饲料，饮用水为无菌水，自由饮食及饮水。实验前先喂养7天，为适应期。
1.3实验主要仪器
金诺JF1204电子天平：深圳华恒仪器有限公司产品
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1.4实验试剂
白蛋白（ALB）试剂盒（批号：20101027）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号：20100922）；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号：20101027）；总胆红素（TBil）试剂盒（批号：20090614），均购自上海锐谷生物科技有限公司。
2 实验方法
2.1半数致死量（LD50）的测定
2.1.1山豆根组小鼠灌胃给药半数致死量（LD50）的测定：
首次预实验：取15只小鼠，雌雄各半，按体质量、性别分层随机法分为3组，每组5只。以20.54g·kg-1为预试1组剂量，按剂量等比级数1∶0.5计算，得到预试2组剂量为10.27g·kg-1、预试3组剂量为5.14g·kg-1。禁食（不禁水）12h后，各组均按25ml/kg灌胃，给药后记录动物的即时反应并连续观察2d，结果不能确定小鼠死亡率（P）为0%的剂量（Dn），因此须进一步确定小鼠死亡率（P）为0%的剂量（Dn）。
二次预实验：取15只小鼠，雌雄各半，按体质量、性别分层随机法分为3组，每组5只，以5.14g·kg-1为最高灌胃剂量，剂量等比级数为1∶0.5，依次取3个浓度给3组小鼠，分别为5.14，2.57，1.29g·kg-1，各组灌胃1次后观察2d。综合2次预试结果，以5.14g·kg-1的剂量灌胃后，P=1；以1.29g·kg-1的剂量灌胃后，P=0。由此，山豆根水煎液Dm约为5.14g·kg-1，Dn约为1.29g·kg-1。见下表。
综合两次预试结果，推测小鼠灌胃山豆根水煎液的死亡率（P）为0%的剂量（Dn）为1.29g·kg-1，小鼠P为100%的剂量（Dm）为5.14g·kg-1。
正式实验：取60只健康小鼠，随机分为6组，其中5组为给药组，1组为对照组，雌雄各半，实验前禁食12h，正常饮水，根据预试验结果中LD0和LD100剂数量，测定组间剂量比值为1：0.76。取配成一定浓度的山豆根水煎液，并设置溶剂对照组，给药组按25ml/kg的给药体积对小鼠进行灌胃，对照组同时灌胃等体积蒸馏水，给药后观察2d；观察并记录动物给药后一般状况和死亡情况，计算LD50及LD50的95%水平的置信区间。
山豆根组小鼠灌胃给药半数致死量（LD50）的结果，见下表。
用Bliss法程序计算得山豆根组小鼠灌胃给药半数致死量LD50为16.4686g/kg，LD50的95%可信限为14.7501～17.6027g/kg。
2.2药物毒性的对照
2.2.1实验动物分组及给药：
健康小鼠30只，雌雄各半，随机分为2组，分别为空白组、山豆根水煎液组，每组15只，各组动物按25ml/kg每日灌胃一次，空白组给以等量的蒸馏水，连续给药14天，给药期间动物自由摄食饮水。未次给药后一定时间，动物禁食不禁水12小时，每组随机抽取小鼠8只，取血进行血生化检测，取血后小鼠处死作系统尸检和病理组织学检查。 2.2.2小鼠给药后一般情况观察：
给药期间每日观察记录小鼠毛色、活动、精神状态、进食饮水、大小便等一般情况及出现的毒性症状、体征；小鼠定时称重，记录给药期体重变化。称重间隔根据各组分给药时间确定，定时检测小鼠日食量、水量变化，检测时间间隔根据各组分给药时间确定。
2.2.3小鼠给药后血液生化学检查：
眼眶静脉丛取血，3000r·min-1，4℃离心10min，用移液器取上层血清，以全自动生化分析仪测定血清中ALB、ALT、AST和TBil。
2.2.4计算肝脏指数并观察小鼠重要组织病理学变化：
摘肝脏并称重量，计算肝脏指数。
3 实验结果
3.1半数致死量（LD50）的计算
实验结束后，将所得数据用Bliss法程序计算得山豆根水煎液组小鼠灌胃给药半数致死量LD50为16.4686g/kg，LD50的95%可信限为14.7501～17.6027g/kg。
3.2给药后小鼠一般状况观察结果
通过观察，实验期间空白对照组的小鼠活动、毛色、精神状况、进食饮水、大小便等一般情况均正常。山豆根组小鼠在给药期间体重增长缓慢，给药后第8天观察，山豆根组小鼠部分出现狂躁、多动、精神不佳、毛色较差、体重增长缓慢等特点，给药后14天山豆根组小鼠体重与空白对照组比较呈显著性差异，随给药时间的延长体重差异增大；山豆根组小鼠在给药期间日摄食量逐渐减少；山豆根组小鼠在给药期间日水量增加缓慢。给药期间体重测定见下表。
3.3给药后小鼠血清生化学检测结果
提取各组小鼠眼眶静脉血清，进行血液生化学检查，结果进行组间t检验，见表6。
结果表示，药后14天，空白对照组的小鼠血清中白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）活力均在正常范围内；小鼠灌胃山豆根水煎液14天，可使小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）活性均明显升高，白蛋白（ALB）含量稍有降低。
4 讨论
半数致死量（LD50）是对药物毒性大小的粗略估计，是评价药物优劣的重要参数。LD50与药物毒性成反比，即致死量越小，毒性越大；致死量越大，毒性越小。本次实验测得的数据说明，作为抗肿瘤用药，山豆根的药物毒性较大，且毒性损伤集中在肝脏。
小鼠血清中ALT、AST、TBil等指标与肝毒性损伤具有很强的相关性，可作为评价中药致肝毒性损伤的一级筛选指标，此次实验结果中可看出，山豆根给药组小鼠的ALT、AST、TBil含量升高，说明山豆根可引起肝毒性损伤。
本实验对抗肿瘤药物山豆根的药物毒性进行了探讨，通过药物毒性评价，为药物的合理应用和进一步研究提供了必要的参考。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010版一部.北京：中国医药科技出版社，2010：25.
[2] 姚光弼.肝脏损伤的机制[J].中华消化杂志，1998.18（4）：235-238.
[3]公素琴，朱盂国.山豆根毒副反应综述[J].云南中医中药杂志，2004，25：48—49.