【摘 要】
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为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp30)获得了表达.将表达rp30的细胞再经G418筛选并采用有限稀释法亚克隆后,采用IFA和western blot鉴定.IFA结果显示,经筛选获得的克隆细胞中有绿色荧光;western blot结果显示,克隆细胞在30 ku～38 k
【机 构】
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中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150069
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为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp30)获得了表达.将表达rp30的细胞再经G418筛选并采用有限稀释法亚克隆后,采用IFA和western blot鉴定.IFA结果显示,经筛选获得的克隆细胞中有绿色荧光;western blot结果显示,克隆细胞在30 ku～38 ku出现3条特异性条带,表明获得了一株表达rp30的细胞ASFV-p30.表达的rp30利用镍柱亲和层析纯化并经western blot鉴定纯化效果后,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,经ELISA和亚克隆筛选MAb.获得的MAb经亚型试剂盒鉴定,并分别经IFA和western blot鉴定该MAb的反应性,采用间接ELISA方法检测MAb的腹水及细胞培养上清液效价,采用western blot检测该MAb与猪源病原ASFV、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的交叉反应性.结果 显示,经ELISA和亚克隆筛选获得一株p30蛋白的MAb 13G2.亚型鉴定结果显示,该MAb重链为IgG1,轻链为K型.IFA和western blot结果显示,该MAb与ASFV-p30细胞表达的p30蛋白有良好的反应原性.ELISA结果显示该MAb的腹水及培养上清效价分别为1∶409600、1∶1024.交叉反应性结果显示,仅ASFV感染的细胞与该MAb作用后出现特异性条带,而其他病原感染的细胞均无特异性条带,表明MAb 13G2的特异性较强.本研究首次利用哺乳动物细胞表达系统表达了ASFV p30蛋白,制备的蛋白更接近天然p30蛋白分子,以该蛋白制备的MAb用于检测ASFV更加准确,为ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速检测奠定了基础.
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