“GOTI”技术让基因编辑脱靶无处遁形

• 出 处: 科学
• 发表日期: 2019年2期

　　[本刊讯]中国科学院神经科学研究所中国科学院灵长类神经生物学重点实验室杨辉研究组与中国科学院计算生物学研究所等单位合作，建立了一种新型基因编辑脱靶检测技术，名为“二细胞胚胎注射法全基因组脱分析”（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection，GOTI），并用该技术发现单碱基编辑有可能导致大量无法预测的脱靶，有严重安全风险。该研究显著提高了脱靶检测的敏感性，可不借助任何脱靶位点预测技术发现以往检测手段无法检出的完全随机的脱靶位点。2019年3月1日成果以题为“胞嘧啶单碱基编辑会导致大量单核苷酸突变脱靶”的研究论文发表于Science。
　　新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9从发明以来，一直以高效性和特异性备受关注，学界普遍认为基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的临床技术将为人类健康做出巨大贡献。但该技术问世以来，其脱靶风险一直备受关注，如将它及其衍生工具用于临床，脱靶效应可能会引发包括癌症在内的很多不良反应。此前推出过多种检测脱靶的方案，它们或者依赖于计算机软件预测，或者依赖于高通量测序检测是否发生双链DNA断裂，以及其他体外检测法。但这些方法都不能高灵敏度地检测到脱靶引起的突变，尤其是碱基突变，故对CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脱靶率一直存有争议，寻求既不依赖于脱靶位点预测又具足够信噪比的精确脱靶检测新手段，成为CRISPR/Cas9及其衍生工具能否最终走上临床的关键。
　　要摆脱脱靶位点预测，必须找到非常严格的对照组来确定基因突变位点，同时为检测不依赖于sgRNA的随机突变，最好使用基于单细胞的全基因组测序。研究者建立了一种名为“GOTI”的脱靶检测技术，在小鼠受精卵分裂到二细胞期时，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个胚胎消化为单细胞，通过红色荧光蛋白，用流式细胞技术分选出基因编辑细胞和未基因编辑细胞进行全基因组测序，比较两组差异。避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题，因实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，直接比对两组细胞的基因组，其差异基本就可认为是基因编辑造成的。
　　借助GOTI检测CRISPR/Cas9系统，发现设计良好的CRISPR/Cas9无明显脱靶效应。而检测其衍生技术——第三代单碱基编辑器（BE3），却发现BE3有非常严重的脱靶，且大多发生在脱靶预测认为不太可能出现的位点。BE3可精确引入点突变，之前从未发现它有明显脱靶问题。分析认为，这些脱靶位点有部分出现在抑癌基因上，BE3有很大隐患，不适用于临床。这些发现证实以BE3为代表的部分基因编辑技术存在无法预测的脱靶风险，必须重新审视。该项研究建立了一种在精度、广度和准确性上远超之前的基因编辑脱靶检测技术，有望开发精度更高、安全性更大的基因编辑工具，建立行业新标准。