论文部分内容阅读
荧光定量PCR(qRT-PCR)是研究分子生物学中基因表达的一种新型核酸定量技术,具备快速高效、特异性强、重复性好、灵敏度高和自动化程度高等优点,因而根据相应的实验材料选择适宜的内参基因对于提高qRT-PCR分析的准确性显得尤为重要.Actin基因表达范围广且表达稳定,常常作为内参基因应用于qRT-PCR表达分析中.前期利用转录组测序(RNA-seq)技术获得了西葫芦低温弱光转录组数据库,本研究从中筛选到1条长达2543bp的cDNA,并对其进行了序列分析.生物信息学分析结果表明,该序列包含1个开放读码框(ORE),大小为2064 bp,预测编码氨基酸数为682个,理论分子大小约为79.67kD,蛋白质等电点为6.28.Wolf Psort分析发现,CpActin蛋白亚细胞定位于细胞核中.Motif Scan分析显示,CpActin蛋白质的氨基酸序列207～406位和558～682位分别为Actin的中端和C端保守区域.同源性分析表明,基因编码的蛋白质与同为南瓜属的中国南瓜和印度南瓜同源蛋白的相似性达到99％,具有高度的保守性.基于所获得的基因全长cDNA序列,设计了基因ORF全长引物对CpActin-F、CpActin-R,经PCR扩增得到一条特异、明亮的条带,经测序验证,序列与RNA-seq数据库的cDNA序列一致,基因命名为CpActin,GenBank登录号为MH211008.在此基础上,设计了一对荧光定量PCR引物CpActin-Fq、CpActin-Rq,分析显示,该引物具有较高的特异性和扩增效率,且在西葫芦不同组织(根、茎、花和果)和不同胁迫处理[正常(25℃,300μmol/m2·s)、低温处理(4℃,300 μmol/m2·s)、弱光处理(25℃,80μmol/m2·s)、低温弱光处理(4℃,80μmol/m2·s)、强光处理(25℃,2000μmol/m2·s)和高温处理(38℃,300μmol/m2·s)]叶片中均能稳定表达,适合在西葫芦基因qRT-PCR表达分析的研究中作为候选内参基因.