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建立了婴幼儿配方食品和奶粉中生物素超高效液相色谱-串联四级杆质谱（UPLC-MS／MS）的检测方法。奶粉经水溶解，再用高氯酸沉淀蛋白，过ENVI-Carb固相萃取柱后，去除奶粉基质的干扰在UPLC-MS／MS条件下，对奶粉中的生物素实现定量分析。工作曲线呈线性，r=0．9996，回收率在90．79％～104．29％之间，相对标准偏差均小于8％，定量限为0．0257μg／g，本方法灵敏度高，抗干扰能力强．是分析婴幼儿配方食品和奶粉中生物素的理想方法。