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摘 要：山蜡梅（Chimonanthus nitens）为腊梅科腊梅属常绿灌木，其叶片中含有多种活性成分。该研究首次采用高效液相色谱、高分辨质谱和二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）联合试验法，对山蜡梅叶片提取物的清除自由基活性及成分进行了研究。结果表明，山蜡梅叶甲醇提取物具有一定的清除DPPH自由基活性，其中安徽黄山、六安和市售的山蜡梅叶对0.4mg/mL DPPH自由基的半数清除浓度分别为2.23、2.31和2.82mg/mL。利用液质联用和清除自由基进行联合分析，山蜡梅叶甲醇提取物的主要成分为C7H12O6、C15H18O9、C15H14O5、C22H26O19和C27H30O16。其中，C15H18O9、C15H14O5和C27H30O16有着较强的清除自由基活性。3种活性化合物可能分别为咖啡酸葡萄糖苷、三羟基黄烷醇和芦丁，其中咖啡酸葡萄糖苷和三羟基黄烷醇为首次从山蜡梅中发现的。
关键词：山蜡梅叶;活性成分;液质联用和DPPH联合分析
中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）19-0013-03
Radical Scavenging Activity and Constituents Analysis of Methanol Extracts from Leaves of Chimonanthus nitens with HPLC-HRMS-DPPH Method
CHEN Qingxiang1 et al.
（1Forestry Bureau of Huoshan Count， Huoshan 237299， China）
Abstract： Chimonanthus nitens which contained several active constituents is an evergreen shrub of the Chimonanthus family. A combined analysis of HPLC-MS and DPPH assay was used for the first time to study radical scavenging activity and components of extract from leaves of Chimonanthus nitens. Results show that extracts from leaves of Chimonanthus nitens possess radical scavenging activity. The half scavenging concentrations of leaves from Huangshan， Liuan and Jiangxi are 2.23， 2.31 and 2.82 mg/mL respectively. Results of HPLC-MS and DPPH assay show that the main components in leaves of Chimonanthus nitens are C7H12O6， C15H18O9， C15H14O5， C22H26O19 and C27H30O16， and C15H18O9， C15H14O5， C27H30O16 have radical scavenging activity. Data base enquiry show the three radical scavengers are possibly lutin， caffeoylglucoside and trihydroxyflavanol and the last compounds were detected from Chimonanthus nitens for the first time.
Key words： Leaves of Chimonanthus nitens; Bioactive constituents; Combined analysis of HPLC-MS and DPPH assay
山蜡梅（Chimonanthus nitens Oliv.）别名亮叶腊梅、毛山茶、岩马桑、香风茶，是我国特有的蜡梅科蜡梅属灌木，主要分布在我国湖北、安徽、江西、江苏、浙江、湖南、广西、云南等省份的山地疏林下或林缘处[1]。山蜡梅在安徽山区普遍分布，山区老百姓习惯用山蜡梅叶做茶饮用，用于防治感冒。据报道，山蜡梅多以叶入药，叶气清香，味微苦而辛凉，具有解表祛风、清热解毒之功效，有预防感冒和治疗慢性气管炎等作用[2]。现代药物化学分析与药效试验证明：山蜡梅叶的主要成分为黄酮、生物碱、肌醇和挥发油，具有抗菌消炎、抗病毒、增强肌体免疫力等功能，且无毒副作用[4-8]。
安徽山区有大量的野生山蜡梅。为做好山蜡梅的开发利用工作，本研究采用高效液相色谱、高分辨质谱和二苯基苦基苯肼自由基试验联用的方法，对安徽山蜡梅叶的清除自由基活性成分进行了研究，并与市售样品进行比较，以期更全面地了解该植物的生物活性，同时为安徽山区的山蜡梅资源开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 山蜡梅叶样品 供试样品于2016年9月分别采自安徽六安和黄山，同时从市场购买产地为江西的干燥山蜡梅叶产品做比较。
1.1.2 化学药品 二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）从Sigma公司购买;溶剂甲醇为国产分析纯;用于液质联用分析的甲醇为美国天地公司的HPLC级甲醇。
1.1.3 主要仪器 酶标仪为美国Molecule Device公司的M2型;电子天平为上海分析仪器厂生产的万分之一天平。高分辨液质联用分析仪，包括美国安捷伦公司的1100型高效液相色谱仪（包括自动进样器、二元高压梯度泵、真空脱氣机和二极阵列检测器），安捷伦6210型飞行时间质谱仪。 1.2 试验方法
1.2.1 样品采集与处理 将采集的山蜡梅新鲜叶放入保鲜袋，24h内进行冷冻干燥，同时将市售样品一同冷冻干燥;称取粉碎的干燥样品30～40mg，按1mg：30μL加甲醇，在室温下条件下恒温振荡浸提48h;10000rpm离心10min，取上清备用。
1.2.2 自由基清除剂活性的测定 取不同浓度的样品溶液100μL和0.4mg/mL DPPH试液100μL，分别加入96孔酶标板中。样品加入后震荡30s，室温下10min后，测定517nm波长下测定其吸光值（Ap）;同时，测定不加DPPH的样品空白吸收值（Ac）和加DPPH但不加样品（以100μL甲醇代替样品）的吸收值（Amax）。最后按下列公式计算：
自由基清除率/%=[1-（Ap-Ac）/Amax]×100
半数自由基清除浓度用回归方程计算 [9-10]。
1.2.3 自由基清除剂组成分析 用高效液相色谱-质谱-DPPH联用法测定。将样品提取物进样10μl进行高分辨液质联用分析，同时按1∶4的分流比收集色谱洗脱物，每分钟收集一管，共进样5次。将相同洗脱时间收集的洗脱物合并，然后在离心浓缩仪中蒸去溶剂。在浓缩干燥的收集管中加100μL甲醇溶解，然后用酶标仪法测定DPPH自由基清除率。
高效液相条件如下：用含0.1%甲酸铵的水和甲醇为流动相进行梯度洗脱：0～3min 100%水;3～35min甲醇由0%上升到100%，35～50用100%甲醇洗脱15min。色谱柱为Waters 3.9×150，5μm，Atlantis柱。紫外检测条件为200～600nm的全波长扫描。质谱检测条件为：离子源为电喷雾（ESI）离子化;阳离子模式的离子化电压为4000V，碎裂电压为265V;阴离子模式的离子化电压为-3500V，碎裂电压为175V。
2 结果与分析
2.1 山蜡梅叶甲醇提取物的自由基清除率 按前述自由基清除活性测试方法，对不同产地不同浓度的山蜡梅叶甲醇提取物进行自由基清除能力测定，其结果见表1。从表1可以看出，在各个浓度下，黄山和六安的山蜡梅叶提取物的自由基清除都大于市售样品;黄山山蜡梅叶提取物对DPPH自由基的半数清除浓度比市售样品低20.92%;六安的山蜡梅叶提取物对DPPH自由基的半数清除浓度比市售样品低18.09%。实验结果表明，黄山和六安的山蜡梅叶具有较强的清除自由基活性，可能有较高的开发利用价值。当然，本实验的黄山和六安的山蜡梅叶是采用冻干处理，能较好地保留所含的活性成分，而市售样颜色暗黄，可能受过烘干等处理，有效成分受到了一定的破坏。
2.2 山蜡梅叶中具有清除自由基活性的成分 高分辨质谱分析的总离子图见图1。山蜡梅叶甲醇提取物有5个主峰，它们对应的阴阳离子质荷比、自由基清除率和可能的分子式见表2。
液质联用分析结果表明，山蜡梅叶甲醇提取物的主要成分为C7H12O6、C15H18O9、C15H14O5、C22H26O19和C27H30O16。液质联用和DPPH联合分析结果显示，C15H18O9、C15H14O5和C27H30O16有较强的清除自由基活性。数据查询发现，这3种具有清除自由基活性的化合物可能分别为咖啡酸葡萄糖苷、三羟基黄烷醇和芦丁。咖啡酸葡萄糖苷和三羟基黄烷醇是首次从山蜡梅叶中发现的。
3 结论
由本次研究可知：（1）供试山蜡梅叶甲醇提取物有清除自由基活性，其中安徽黄山、六安和江西（市售）的山蜡梅叶对0.4mg/mL DPPH自由基的半数清除浓度分别为2.23、2.31和2.82mg/mL。（2）液质联用分析结果表明，山蜡梅叶甲醇提取物的主要成分为C7H12O6、C15H18O9、C15H14O5、C22H26O19和C27H30O16。（3）C15H18O9、C15H14O5和C27H30O16有较强的清除自由基活性。（4）3种具有清除自由基活性的化合物可能分别为咖啡酸葡萄糖苷、三羟基黄烷醇和芦丁，其中咖啡酸葡萄糖苷和三羟基黄烷醇是首次从山蜡梅叶中发现的。
参考文献
[1]孙祥钟.中国植物志（第8卷）[M].北京：科学出版社，1998：176-180.
[2]李时珍.本草纲目（第19卷）[M].北京：中国书店，1988：102.
[3]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986：1522.
[4]肖炳坤，刘耀明，冯淑香.山蜡梅叶的化学成分研究[J].中草药，2005，02：187-189.
[5]聂韡，房海灵，黄丽莉，等.山蜡梅叶中3种黄酮类成分含量动态变化研究[J].江西农业大学学报，2013，35（2）：357-360.
[6]杜裕芳，陈海芳，冯育林，等.腊梅属植物的化学成分及药理作用研究进展[J].时珍国药，2013，24（8）：1981-1983.
[7]Li Qi-Ji，Wang Ming-Li，Yang Xiao-Sheng，et al.Two new coumarin glycosides from Chimonanthus nitens [J]. Journal of Asian Natural Products Research，2013，15（3）：1-6.
[8]Bin Zhou，Miao Tan，Jing-feng Lu，et al. Simultaneous determination of five active compounds in chimonanthus nitens by double-development HPTLC and scanning densitometry [J]. Chemistry Central Journal，2012，6（46）：2-5.
[9]HU Fenglin，LU RL，Huang B，et al.Free radical scavenging activity of extracts prepared from fresh leaves of selected Chinese medicinal plants [J].Fitoterapia，2004，75：14-23.
[10]胡豐林，陆瑞利等.尼日利亚螫毛果（Cnestis ferruginca）中一种具有清除自由基的活性化合物的分离鉴定 [J].武汉植物研究，2002，20（4）：311-314.
（责编：张宏民）
关键词：山蜡梅叶;活性成分;液质联用和DPPH联合分析
中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）19-0013-03
Radical Scavenging Activity and Constituents Analysis of Methanol Extracts from Leaves of Chimonanthus nitens with HPLC-HRMS-DPPH Method
CHEN Qingxiang1 et al.
（1Forestry Bureau of Huoshan Count， Huoshan 237299， China）
Abstract： Chimonanthus nitens which contained several active constituents is an evergreen shrub of the Chimonanthus family. A combined analysis of HPLC-MS and DPPH assay was used for the first time to study radical scavenging activity and components of extract from leaves of Chimonanthus nitens. Results show that extracts from leaves of Chimonanthus nitens possess radical scavenging activity. The half scavenging concentrations of leaves from Huangshan， Liuan and Jiangxi are 2.23， 2.31 and 2.82 mg/mL respectively. Results of HPLC-MS and DPPH assay show that the main components in leaves of Chimonanthus nitens are C7H12O6， C15H18O9， C15H14O5， C22H26O19 and C27H30O16， and C15H18O9， C15H14O5， C27H30O16 have radical scavenging activity. Data base enquiry show the three radical scavengers are possibly lutin， caffeoylglucoside and trihydroxyflavanol and the last compounds were detected from Chimonanthus nitens for the first time.
Key words： Leaves of Chimonanthus nitens; Bioactive constituents; Combined analysis of HPLC-MS and DPPH assay
山蜡梅（Chimonanthus nitens Oliv.）别名亮叶腊梅、毛山茶、岩马桑、香风茶，是我国特有的蜡梅科蜡梅属灌木，主要分布在我国湖北、安徽、江西、江苏、浙江、湖南、广西、云南等省份的山地疏林下或林缘处[1]。山蜡梅在安徽山区普遍分布，山区老百姓习惯用山蜡梅叶做茶饮用，用于防治感冒。据报道，山蜡梅多以叶入药，叶气清香，味微苦而辛凉，具有解表祛风、清热解毒之功效，有预防感冒和治疗慢性气管炎等作用[2]。现代药物化学分析与药效试验证明：山蜡梅叶的主要成分为黄酮、生物碱、肌醇和挥发油，具有抗菌消炎、抗病毒、增强肌体免疫力等功能，且无毒副作用[4-8]。
安徽山区有大量的野生山蜡梅。为做好山蜡梅的开发利用工作，本研究采用高效液相色谱、高分辨质谱和二苯基苦基苯肼自由基试验联用的方法，对安徽山蜡梅叶的清除自由基活性成分进行了研究，并与市售样品进行比较，以期更全面地了解该植物的生物活性，同时为安徽山区的山蜡梅资源开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 山蜡梅叶样品 供试样品于2016年9月分别采自安徽六安和黄山，同时从市场购买产地为江西的干燥山蜡梅叶产品做比较。
1.1.2 化学药品 二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）从Sigma公司购买;溶剂甲醇为国产分析纯;用于液质联用分析的甲醇为美国天地公司的HPLC级甲醇。
1.1.3 主要仪器 酶标仪为美国Molecule Device公司的M2型;电子天平为上海分析仪器厂生产的万分之一天平。高分辨液质联用分析仪，包括美国安捷伦公司的1100型高效液相色谱仪（包括自动进样器、二元高压梯度泵、真空脱氣机和二极阵列检测器），安捷伦6210型飞行时间质谱仪。 1.2 试验方法
1.2.1 样品采集与处理 将采集的山蜡梅新鲜叶放入保鲜袋，24h内进行冷冻干燥，同时将市售样品一同冷冻干燥;称取粉碎的干燥样品30～40mg，按1mg：30μL加甲醇，在室温下条件下恒温振荡浸提48h;10000rpm离心10min，取上清备用。
1.2.2 自由基清除剂活性的测定 取不同浓度的样品溶液100μL和0.4mg/mL DPPH试液100μL，分别加入96孔酶标板中。样品加入后震荡30s，室温下10min后，测定517nm波长下测定其吸光值（Ap）;同时，测定不加DPPH的样品空白吸收值（Ac）和加DPPH但不加样品（以100μL甲醇代替样品）的吸收值（Amax）。最后按下列公式计算：
自由基清除率/%=[1-（Ap-Ac）/Amax]×100
半数自由基清除浓度用回归方程计算 [9-10]。
1.2.3 自由基清除剂组成分析 用高效液相色谱-质谱-DPPH联用法测定。将样品提取物进样10μl进行高分辨液质联用分析，同时按1∶4的分流比收集色谱洗脱物，每分钟收集一管，共进样5次。将相同洗脱时间收集的洗脱物合并，然后在离心浓缩仪中蒸去溶剂。在浓缩干燥的收集管中加100μL甲醇溶解，然后用酶标仪法测定DPPH自由基清除率。
高效液相条件如下：用含0.1%甲酸铵的水和甲醇为流动相进行梯度洗脱：0～3min 100%水;3～35min甲醇由0%上升到100%，35～50用100%甲醇洗脱15min。色谱柱为Waters 3.9×150，5μm，Atlantis柱。紫外检测条件为200～600nm的全波长扫描。质谱检测条件为：离子源为电喷雾（ESI）离子化;阳离子模式的离子化电压为4000V，碎裂电压为265V;阴离子模式的离子化电压为-3500V，碎裂电压为175V。
2 结果与分析
2.1 山蜡梅叶甲醇提取物的自由基清除率 按前述自由基清除活性测试方法，对不同产地不同浓度的山蜡梅叶甲醇提取物进行自由基清除能力测定，其结果见表1。从表1可以看出，在各个浓度下，黄山和六安的山蜡梅叶提取物的自由基清除都大于市售样品;黄山山蜡梅叶提取物对DPPH自由基的半数清除浓度比市售样品低20.92%;六安的山蜡梅叶提取物对DPPH自由基的半数清除浓度比市售样品低18.09%。实验结果表明，黄山和六安的山蜡梅叶具有较强的清除自由基活性，可能有较高的开发利用价值。当然，本实验的黄山和六安的山蜡梅叶是采用冻干处理，能较好地保留所含的活性成分，而市售样颜色暗黄，可能受过烘干等处理，有效成分受到了一定的破坏。
2.2 山蜡梅叶中具有清除自由基活性的成分 高分辨质谱分析的总离子图见图1。山蜡梅叶甲醇提取物有5个主峰，它们对应的阴阳离子质荷比、自由基清除率和可能的分子式见表2。
液质联用分析结果表明，山蜡梅叶甲醇提取物的主要成分为C7H12O6、C15H18O9、C15H14O5、C22H26O19和C27H30O16。液质联用和DPPH联合分析结果显示，C15H18O9、C15H14O5和C27H30O16有较强的清除自由基活性。数据查询发现，这3种具有清除自由基活性的化合物可能分别为咖啡酸葡萄糖苷、三羟基黄烷醇和芦丁。咖啡酸葡萄糖苷和三羟基黄烷醇是首次从山蜡梅叶中发现的。
3 结论
由本次研究可知：（1）供试山蜡梅叶甲醇提取物有清除自由基活性，其中安徽黄山、六安和江西（市售）的山蜡梅叶对0.4mg/mL DPPH自由基的半数清除浓度分别为2.23、2.31和2.82mg/mL。（2）液质联用分析结果表明，山蜡梅叶甲醇提取物的主要成分为C7H12O6、C15H18O9、C15H14O5、C22H26O19和C27H30O16。（3）C15H18O9、C15H14O5和C27H30O16有较强的清除自由基活性。（4）3种具有清除自由基活性的化合物可能分别为咖啡酸葡萄糖苷、三羟基黄烷醇和芦丁，其中咖啡酸葡萄糖苷和三羟基黄烷醇是首次从山蜡梅叶中发现的。
参考文献
[1]孙祥钟.中国植物志（第8卷）[M].北京：科学出版社，1998：176-180.
[2]李时珍.本草纲目（第19卷）[M].北京：中国书店，1988：102.
[3]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1986：1522.
[4]肖炳坤，刘耀明，冯淑香.山蜡梅叶的化学成分研究[J].中草药，2005，02：187-189.
[5]聂韡，房海灵，黄丽莉，等.山蜡梅叶中3种黄酮类成分含量动态变化研究[J].江西农业大学学报，2013，35（2）：357-360.
[6]杜裕芳，陈海芳，冯育林，等.腊梅属植物的化学成分及药理作用研究进展[J].时珍国药，2013，24（8）：1981-1983.
[7]Li Qi-Ji，Wang Ming-Li，Yang Xiao-Sheng，et al.Two new coumarin glycosides from Chimonanthus nitens [J]. Journal of Asian Natural Products Research，2013，15（3）：1-6.
[8]Bin Zhou，Miao Tan，Jing-feng Lu，et al. Simultaneous determination of five active compounds in chimonanthus nitens by double-development HPTLC and scanning densitometry [J]. Chemistry Central Journal，2012，6（46）：2-5.
[9]HU Fenglin，LU RL，Huang B，et al.Free radical scavenging activity of extracts prepared from fresh leaves of selected Chinese medicinal plants [J].Fitoterapia，2004，75：14-23.
[10]胡豐林，陆瑞利等.尼日利亚螫毛果（Cnestis ferruginca）中一种具有清除自由基的活性化合物的分离鉴定 [J].武汉植物研究，2002，20（4）：311-314.
（责编：张宏民）