【摘 要】
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目的 鉴定刚地弓形虫假定蛋白TGGT1_310420在速殖子阶段的功能及其蛋白N端序列的亚细胞定位作用. 方法 在线设计针对TGGT1 310420的sgRNA,通过定点突变弓形虫CRISPR/Cas9载体
【机 构】
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首都医科大学附属北京友谊医院,北京热带医学研究所,热带病防治北京市重点实验室,北京100050
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目的 鉴定刚地弓形虫假定蛋白TGGT1_310420在速殖子阶段的功能及其蛋白N端序列的亚细胞定位作用. 方法 在线设计针对TGGT1 310420的sgRNA,通过定点突变弓形虫CRISPR/Cas9载体pSAG1::CAS9-GFP-U6::sgUPRT上的sgRNA序列获得针对TGGT1_310420的CRISPR/Cas9载体.利用CRISPR/Cas9编辑技术将含有荧光蛋白mCherry和弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的PCR片段mCherry-Ty_HXGPRT插入至TGGT1_310420内源基因编码N端前20个氨基酸残基之后.通过PCR鉴定片段是否正确插入;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析检测融合蛋白的表达情况.间接免疫荧光分析和共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位;空斑实验检测基因缺失株虫体表型的变化. 结果 PCR和测序结果显示,成功构建了针对TGGT1_310420的CRISPR/Cas9载体,mCherry-Ty_HXGPRT序列定点插入至靶点位置.蛋白质印迹分析结果显示,mCherry融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为36 000;间接免疫荧光实验表明mCherry融合蛋白与弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)共定位于虫体的表膜.空斑实验检测结果显示,TrGGT1 _310420的缺失并未引起虫体出现可测的表型变化. 结论 TGGT1_310420编码蛋白前20个氨基酸残基序列具有定位到弓形虫表膜的功能,TGGT1_310420在弓形虫速殖子阶段为非必需基因.
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