【摘 要】
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目的:构建杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区(KMD)基因原核表达载体并表达纯化KMD.方法:通过软件和在线工具预测KMD的理化性质.构建KMD的原核表达载体pET28a-KMD,而后
【机 构】
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郑州大学生物工程系细胞生物学研究室,中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室
【基金项目】
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2009-2010年生物大分子国家重点实验室开放课题;国家自然科学基金
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目的:构建杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区(KMD)基因原核表达载体并表达纯化KMD.方法:通过软件和在线工具预测KMD的理化性质.构建KMD的原核表达载体pET28a-KMD,而后在大肠杆菌BL21(DE3)内16℃过夜诱导表达KMD,通过超声破碎菌体和高速离心,将上清液进行亲和层析.获得粗纯目的蛋白,再利用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化.SDS-PAGE检测层析各阶段蛋白样品.将纯化后的KMD均分3份分别放置在-80℃、4℃和18℃环境中,1周后SDS-PAGE检测目的蛋白是否降解.结果:KMD相对分子质量为37 480,预测pI为7.99.基因中含有的稀有密码子不会明显影响其在大肠杆菌BL21( DE3)中表达.多步层析后可以获得2个独立的目的蛋白洗脱峰,均为KMD且纯度可满足结晶条件搜索.纯化后的KMD在4℃和18℃下放置1周后无降解.结论:获得大量高纯度、均一性良好的KMD蛋白,能够满足培养蛋白晶体所需.
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